Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
16 марта 2003 года
Дата введения -
1 июля 2003 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ СПИРОКСАМИНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ,
ЗЕРНЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ И СОЛОМЕ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР, ВИНОГРАДЕ
МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1228-03
1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им.
Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной
академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии
Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).
Разработчики методик контроля указаны в конце каждой из них.
2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией
по госсанэпиднормированию при Минздраве России.
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем
Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН
Г.Г. Онищенко 16 марта 2003 года.
4. Введены впервые.
1. Вводная часть
Название действующего вещества: спироксамин (ИСО).
Торговое название: Фалькон.
Фирма-производитель: Байер, Германия.
8-третбутил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-ил-метил(этил)(пропил)-
амин (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: С H NO .
18 35 2
Молекулярная масса: 297,5.
Существует в виде смеси диастереоизомеров 1:2 = 49 - 56%:51 -
44%. Ниже приведены (если не указано особо) свойства для смеси
диастереоизомеров.
Вязкая жидкость бледно-желтого цвета без запаха. Температура
кипения 120 -С при 6,7 Ра. Давление паров 9,7 mРа (20 -С) и 17 mРа
(25 -С) для изомеров 1 и 2, соответственно.
Хорошо растворим в органических растворителях. Растворимость
при 20 -С в ацетоне, ацетонитриле, дихлорметане, гексане,
пропаноле, толуоле более 200 г/л. Растворимость в воде при 20 -С
(г/л): при рН 3 - > 200; при рН 7 - 0,470 (изомер 1) и 0,340
(изомер 2); при рН 9 - 0,014 (изомер 1) и 0,010 (изомер 2).
Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода
K lg P = 2,79 (изомер 1) и 2,92 (изомер 2).
ow
Спироксамин не разлагается в течение 30 дней при 25 -С в
водных растворах с диапазоном рН от 5 до 9. Период полураспада
изомера 1 и изомера 2 в водных растворах с рН 2,1 при 37 -С
6,1 и 15,4 ч, соответственно. Изомер 1 разрушается при повышенных
температурах. Изомер 2 термостабилен.
Значения рК составляют 6,9 как для изомера 1, так и для
изомера 2.
ЛД для крыс 500 - 595 мг/кг. Класс токсичности по ВОЗ - III.
50
Гигиенические нормативы для спироксамина:
ПДК в почве (мг/кг) - 0,4
ОДУ в воде водоемов (мг/куб. дм) - 0,0025
МДУ в зерне хлебных злаков (мг/кг) - 0,2
ВМДУ в винограде - 0,1
Область применения: Фалькон, КЭ - комбинированный фунгицид
широкого спектра действия на посевах зерновых культур и
виноградниках, содержит спироксамина 250 мг/л + тебуконазола 167
г/л + триадименола 43 г/л.
2. Методика определения остаточных количеств
спироксамина в воде, почве, зерне, зеленой массе и соломе
злаковых культур, винограде методом газожидкостной
хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на извлечении спироксамина из проб
растворителем с последующей очисткой перераспределением между
двумя не смешивающимися жидкостями и на колонке с окисью алюминия
или флорисилом. Количественное определение проводят методом
газожидкостной хроматографии с термоионным детектором.
2.1.2. Избирательность метода
Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов
анализируемых проб, сочетанием селективного детектора и условий
хроматографирования. В предлагаемых условиях метод специфичен в
присутствии пестицидов, применяемых для борьбы с сорной
растительностью, защиты овощных и масличных культур от вредителей
и болезней (хлор и фосфорорганические пестициды, амиды, тио- и
дитиокарбаматы, синтетические пиретроиды).
2.1.3. Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 -
2.
Таблица 1
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕТОДА
----------T-------T------------T----------T---------T------------¬
¦Анализи- ¦Предел ¦Диапазон ¦Среднее ¦Относи- ¦Доверитель- ¦
¦руемый ¦обнару-¦определяемых¦значение ¦тельное ¦ный интервал¦
¦объект ¦жения, ¦концентра- ¦опреде- ¦стандарт-¦среднего при¦
¦ ¦мг/кг ¦ций, мг/кг ¦ления, % ¦ное от- ¦n = 5 и ¦
¦ ¦ ¦ ¦(n = 24) ¦клонение,¦р = 0,95, ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦%, +/- ¦%, +/- ¦
+---------+-------+------------+----------+---------+------------+
¦Вода ¦0,002 ¦0,002 - 0,02¦86 ¦6,2 ¦5,4 ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+-------+------------+----------+---------+------------+
¦Почва ¦0,2 ¦0,2 - 2 ¦85 ¦9,1 ¦7,9 ¦
+---------+-------+------------+----------+---------+------------+
¦Зерно ¦0,1 ¦0,1 - 1 ¦80 ¦9,8 ¦8,6 ¦
+---------+-------+------------+----------+---------+------------+
¦Солома и ¦0,1 ¦0,1 - 0,2 ¦75 ¦11,5 ¦10,0 ¦
¦зеленая ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦масса ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦растений ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+---------+-------+------------+----------+---------+------------+
¦Виноград ¦0,05 ¦0,05 - 0,5 ¦85 - ягоды¦5,2 ¦4,7 ¦
¦ ¦ ¦ ¦88 - сок ¦4,8 ¦4,4 ¦
L---------+-------+------------+----------+---------+-------------
Таблица 2
СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ
ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ
СПИРОКСАМИНА ПРИ P = 0,95 и N = 5
--------------T-----------T-----------T-----------T--------------¬
¦Анализируемый¦Внесено ¦Определено ¦Доверитель-¦ Средняя ¦
¦ объект ¦спироксами-¦спирокса- ¦ный интер- ¦ полнота ¦
¦ ¦на, мг/кг ¦мина, мг/кг¦вал, +/- ¦определения, %¦
¦ ¦(л) ¦(л) ¦ ¦ ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Вода ¦0,002 ¦0,00174 ¦0,00011 ¦87 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,004 ¦0,0034 ¦0,00018 ¦85 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,008 ¦0,00695 ¦0,00040 ¦87 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,02 ¦0,0172 ¦0,00068 ¦86 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Почва ¦0,2 ¦0,165 ¦0,0145 ¦83 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,4 ¦0,325 ¦0,0275 ¦82 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦1 ¦0,92 ¦0,0465 ¦92 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦2 ¦1,71 ¦0,132 ¦85 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Зерно ¦0,1 ¦0,071 ¦0,013 ¦71 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,25 ¦0,193 ¦0,0185 ¦77 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,5 ¦0,42 ¦0,027 ¦84 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,1 ¦0,89 ¦0,049 ¦89 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Зеленая масса¦0,1 ¦0,072 ¦0,0135 ¦72 ¦
¦растений и +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦солома ¦0,25 ¦0,178 ¦0,019 ¦71 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,5 ¦0,38 ¦0,035 ¦76 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦1,0 ¦0,81 ¦0,075 ¦81 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Виноград - ¦0,05 ¦0,0438 ¦0,002 ¦87,5 ¦
¦ягоды +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,1 ¦0,0915 ¦0,003 ¦91,5 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,2 ¦0,0162 ¦0,008 ¦80,8 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,5 ¦0,4085 ¦0,010 ¦81,7 ¦
+-------------+-----------+-----------+-----------+--------------+
¦Виноград - ¦0,05 ¦0,0423 ¦0,003 ¦85,5 ¦
¦сок +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,1 ¦0,0870 ¦0,002 ¦87,0 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,2 ¦0,1738 ¦0,008 ¦86,9 ¦
¦ +-----------+-----------+-----------+--------------+
¦ ¦0,5 ¦0,4595 ¦0,009 ¦91,9 ¦
L-------------+-----------+-----------+-----------+---------------
Минимально детектируемое количество спироксамина для
хроматографа "Цвет" серии 500 с термоионным детектором - 2,5 нг,
для импортных хроматографов (HP 5840, PYE UNICAM 204) - 0,5 нг.
Граница суммарной погрешности измерения - 12%.
Линейный диапазон детектирования ("Цвет-550") - 2,5 - 25 нг,
для импортных хроматографов - 1 - 20 нг.
2.2. Реактивы и материалы
Спироксамин (KWG 4168) аналитический
стандарт, 99,0% (Байер АГ, Германия)
Алюминия оксид II степени активности
по Брокману ТУ 6-09-3916-75
Флорисил для хроматографии (0,150 -
0,250 мм), фирмы Merck, имп.
Азот газообразный высокой чистоты ТУ 6-16-40-14-88
Гелий очищенный марки Б в баллонах с
редуктором МРТУ 6-09-374-86
Ацетон, х.ч. ТУ 6-09-3513-82
н-Гексан, ч., свежеперегнанный ТУ 6-09-3375-78
Натрий сернокислый безводный, ч.д.а.,
свежепрокаленный ГОСТ 4166-76
Гидроксид натрия, х.ч., 0,25 М и 1 М водные
растворы ГОСТ 4328-77
Хлористый метилен, х.ч. ТУ 6-09-2662-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Насадки для колонок: 5% SP-2100 на хромосорбе
W (0,20 - 0,25 мм), имп.
5% SE-30 на хроматоне N-Super
(0,16 - 0,20 мм), имп.
Неподвижная жидкая фаза OV-17, Супелко Инк,
США
Неподвижная жидкая фаза PS-400, Alltech
Associates, Inc., США
Неподвижная жидкая фаза SE-30, Супелко Инк,
США
Хромосорб 750 зернением 100 - 120 меш, Serva,
Германия
Хроматон N-AW DMCS зернением 0,2 - 0,25 мм,
Хемапол, Чехия
Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,6 г)
Калий фосфорнокислый, однозамещенный
и 0,1 М водный раствор ГОСТ 4198-75
Раствор ацетон-0,1 М КН РО в соотношении
2 4
1:1 по объему
Спирт этиловый ГОСТ 5962-91
Хлороформ, ч.д.а. ГОСТ 20015-74
Этилацетат, х.ч. ГОСТ 22300-76
Бумага фильтровальная ТУ 6.091678-86
Универсальная индикаторная бумага
или рН-метр ГОСТ 13681-93
Стекловата
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Газовый хроматограф Цвет 550 или
аналогичный с термоионным детектором и
стеклянной насадочной колонкой, длиной
1,8 - 2 м, внутренним диаметром 2 - 3 мм
Аппарат для встряхивания ТУ 6-921-1084-73
Баня водяная ТУ 64-1-2850-76
Ванна ультразвуковая "Серьга" ТУ 3.836.008
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 34104-80
Весы технические ВЛКТ-500 или аналогичные ГОСТ 24104-80
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Воронки делительные на 250 и 500 мл ГОСТ 8613-75
Испаритель вакуумный ротационный ИР-1М
или аналогичный ТУ 25-11917-74
Колбы круглодонные вместимостью 50, 100,
250 и 500 мл ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 25336-82
Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 мл ГОСТ 1770-74
Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная
зерновая ЛМЗ ТУ 1-01-0593-79
Микропипетки ГОСТ 20292-74
Микрошприц МШ-10, МШ-10М ТУ 2-833-106
Насос стеклянный вакуумный водоструйный ГОСТ 10696-75
Палочки стеклянные ГОСТ 25336-82
рН-метр ГОСТ 13681-93
Пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 мл ГОСТ 22292-74
Стаканы химические ГОСТ 25336-82Е
Хроматографические стеклянные колонки,
длиной 300 и 350 мм, диаметром 12 мм
Цилиндры мерные вместимостью 10, 100 и
1000 мл ГОСТ 1774-74
Пробирки с притертыми пробками на 10, 20 мл ГОСТ 1770-74
Алонж прямой с отводом для вакуума для
работы с концентрирующими патронами
2.4. Подготовка к определению
2.4.1. Подготовка и кондиционирование колонок для
газожидкостной хроматографии
Готовую насадку (5% PS-400 или 3% OV-17 на хромосорбе 750, или
5% SE-30 на хроматоне N, или 5% SP-2100 на хромосорбе W) засыпают
в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку
устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к
детектору, и выдерживают при температуре 250 -С в токе газа-
носителя в течение 10 - 12 ч.
2.4.2. Подготовка растворителей и приготовление растворов
Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки
не требуют.
Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для
этого 100 мл растворителя помещают в круглодонную колбу, испаряют
при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40
-С досуха, обмывают стенки колбы 1 мл ацетона и хроматографируют
по п. 2.6.1. При обнаружении примесей, которые могут мешать
определению, растворители очищают общепринятыми методами.
0,1 М раствор КН РО . Навеску 13,6 г однозамещенного фосфата
2 4
калия помещают в мерную колбу на 1 л. Добавляют в колбу 600 - 700
мл дистиллированной воды. Перемешивают содержимое колбы до полного
растворения соли, после чего доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. рН раствора должен быть в диапазоне 4,5 -
5,0. Содержимое колбы перемешивают.
1 М раствор NaOH. Навеску 40 г гидроокиси натрия помещают в
мерную колбу на 1 л. Добавляют в колбу 200 - 300 мл
дистиллированной воды. Перемешивают содержимое колбы до полного
растворения гидроокиси натрия. После охлаждения раствора до
комнатной температуры доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Содержимое колбы перемешивают.
0,25 М раствор NaOH. Навеску 5 г гидроксида натрия помещают в
мерную колбу на 0,5 л, добавляют 200 мл дистиллированной воды и
перемешивают до полного растворения. После охлаждения раствора
доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Содержимое
колбы перемешивают.
Раствор ацетон-0,1 М КН РО в соотношении 1:1 по объему. В
2 4
мерную колбу на 1 л помещают 500 мл ацетона, затем доводят объем
раствора до метки, наливая в ту же колбу 0,1 М раствор КН РО .
2 4
Содержимое колбы перемешивают.
2.4.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Взвешивают 100 мг аналитического стандарта спироксамина,
переносят в мерную колбу объемом 100 мл, доводят объем до метки
ацетоном (стандартный раствор с концентрацией спироксамина 1
мг/мл).
Градуировочные растворы с концентрациями 1; 2; 2,5; 5; 10; 25
мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему.
Стандартный раствор устойчив при хранении в холодильнике при
температуре 0 - 4 -С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы
- 1 месяц.
Для построения градуировочного графика - зависимости высоты
(мм) или площади (мв х с) пика на хроматограмме от концентрации
раствора (мкг/мл), в хроматограф вводят по 1 - 2 мкл
градуировочных растворов (не менее 3 параллельных определений для
каждого раствора).
Градуировочные растворы используют также для внесения в
контрольные образцы с целью определения полноты извлечения
спироксамина.
2.4.4. Подготовка окиси алюминия и хроматографических колонок
для очистки экстрактов
Сорбент прокаливают в муфельной печи при температуре 350 -С в
течение не менее 16 ч, остужают в эксикаторе до комнатной
температуры и помещают в плоскодонную колбу. Добавляют 3%
дистиллированной воды (по весу), закрывают колбу пробкой и
энергично встряхивают сначала в течение 5 мин. вручную, а затем
два часа на механическом встряхивателе. Колбу оставляют на 48 ч,
периодически, через каждые 2 ч, в течение рабочего дня энергично
встряхивая ее содержимое 5 - 10 мин.
В нижнюю часть колонки для очистки экстрактов помещают тампон
из стекловаты. Заполняют колонку на 1/4 этилацетатом. Навеску
сорбента (14 г) смешивают в химическом стакане с 15 - 20 мл
этилацетата. Заполняют колонку полученной суспензией.
Дополнительно в верхнюю часть колонки над сорбентом помещают слой
безводного сульфата натрия (1 - 1,5 г). Уровень растворителя над
слоем сульфата натрия должен составлять 10 - 15 мм. Пропускают
через колонку 20 мл этилацетата.
Для каждой приготовленной партии сорбента проверяют объем
удерживания спироксамина на хроматографической колонке. Для этого
уровень растворителя в хроматографической колонке понижают почти
до верхнего слоя сорбента. При помощи стеклянной или
автоматической пипетки вносят 1 мл стандартного раствора
спироксамина с концентрацией 10 мкг/мл. Дают раствору впитаться,
приоткрывая кран колонки и осторожно сливая растворитель, так
чтобы слой растворителя над верхним краем сорбента составлял ~ 0,5
см. Элюируют спироксамин из колонки этилацетатом со скоростью 2
мл/мин., отбирая фракции объемом 10 мл в цилиндры на 10 мл. Всего
отбирают 6 - 7 фракций. Из цилиндров растворы переливают в
круглодонные колбы на 50 мл (каждую фракцию помещают в отдельную
колбу). Каждый цилиндр ополаскивают 1 - 2 мл этилацетата, который
также вносят в соответствующую колбу. Выпаривают растворитель
досуха, сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая
стенки колб, и хроматографируют. Суммарный объем первых фракций, в
которых не обнаружен спироксамин, представляет собой объем
растворителя, который необходимо отбросить при элюировании
спироксамина из колонки при очистке проб. Суммарный объем фракций,
в которых обнаружен спироксамин, представляет собой объем
растворителя, который необходим для элюирования спироксамина из
колонки при очистке проб.
Для очистки проб винограда (ягоды, сок) используют
хроматографические колонки длиной 300 мм и диаметром 12 мм. В
нижнюю часть колонки помещают тампон из стекловаты, заполняют
колонку флорисилом (4 г) и дополнительно в верхнюю часть колонки
вносят слой безводного сульфата натрия высотой 10 мм. После этого
колонку промывают 10 мл чистого н-гексана.
2.4.5. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 (0,6 г)
для очистки виноградного сока
Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума,
подсоединенного к водоструйному насосу. Сверху в патрон вставляют
шприц с разъемом типа Льюер объемом не менее 10 мл (используется
как емкость для элюентов). Для активации и кондиционирования
патрона через него последовательно пропускают 5 мл хлористого
метилена, 10 мл ацетона, 10 мл 0,1 н NaOH. Элюат отбрасывают.
Скорость потока через патрон не должна превышать 1 - 2 мл/мин.
После кондиционирования патрона нельзя допускать высыхания
поверхности картриджа и попадания в него пузырьков воздуха. После
кондиционирования патрон сразу же используется для работы или
герметично закрывается прилагаемыми к нему заглушками с обоих
концов для последующего использования.
2.4.6. Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения
производится в соответствии с требованиями стандартов и
технической документации.
2.5. Отбор и подготовка проб
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными
правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов
питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств
пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного
санитарного врача СССР 21 августа 1979 г. N 2051-79.
Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной
влажности и хранят в стеклянной или бумажной таре при комнатной
температуре. Замороженные образцы зеленой массы и винограда хранят
в морозильной камере при температуре не выше -18 -С. Для
длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной
температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные
образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву
просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому
измельчают на лабораторных мельницах.
Для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при
температуре -18 -С.
2.6. Проведение определения
2.6.1. Экстракция
Вода. Пробу анализируемой воды (250 мл) помещают в делительную
воронку на 250 мл, подщелачивают 1 н NaOH до рН 7,5 - 8,5,
добавляют 30 мл хлороформа. Воронку встряхивают 2 мин., дают
разделиться слоям. После полного разделения слоев хлороформ
(нижний слой) сливают в круглодонную колбу на 250 мл, фильтруя
через фильтр "белая лента" со слоем безводного сульфата натрия.
Повторяют экстракцию еще дважды, каждый раз используя по 30 мл
хлороформа. Фильтр с сульфатом натрия промывают 20 мл хлороформа.
Воду отбрасывают. Объединенный экстракт выпаривают досуха на
вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40
-С. Сухой остаток растворяют в 2 - 3 мл этилового спирта и
выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при
температуре бани не выше 40 -С. Операцию с этанолом повторяют еще
дважды. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют
по п. 2.7.1.
В случае наличия на хроматограммах проб, мешающих определению
коэкстрактивных соединений проводят дополнительную очистку
экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.
Почва. Навеску почвы (25 г) помещают в плоскодонную колбу на
250 мл, приливают 100 мл раствора ацетона в 0,1 М КН РО в
2 4
соотношении 1:1 (по объему). Колбу со смесью встряхивают на
механическом встряхивателе в течение 30 мин. Содержимое колбы
фильтруют в круглодонную колбу на 500 мл через фильтр "белая
лента" методом декантации. Экстракцию повторяют дважды, один раз
используя 100 мл раствора ацетона в 0,1 М КН РО и встряхивая 30
2 4
мин., а затем - 50 мл той же смеси, встряхивая 10 мин.
Объединенный экстракт выпаривают на вакуумном ротационном
испарителе при температуре бани не выше 40 -С до объема
примерно 150 мл (до прекращения энергичного отгона растворителя
в приемную колбу ротационного испарителя). Далее проводят
очистку экстракта по п. 2.6.2.
Зерно, зеленая масса и солома. Навеску растительного материала
(20 г) помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, добавляют 150 мл
ацетона. Колбу с пробой встряхивают на механическом встряхиватели
в течение 30 мин. Содержимое колбы фильтруют в стакан методом
декантации через фильтр "белая лента" в круглодонную колбу на 500
мл. Экстракцию повторяют при тех же условиях. Колбу с пробой и
осадок на фильтре промывают 50 мл ацетона. Объединенный экстракт
упаривают до объема 3 - 4 мл на вакуумном ротационном испарителе
при температуре бани не выше 45 -С. Далее проводят очистку
экстракта по п. 2.6.2.
Виноград. Ягоды винограда. Навеску ягод винограда 50 г
измельчают, помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 100
мл раствора ацетон-хлористый метилен в соотношении 1:1 и
экстрагируют спироксамин в ультразвуковой ванне 10 мин. Экстракт
фильтруют через бумажный фильтр (белая лента). К оставшемуся
остатку добавляют 50 мл смеси ацетон-хлористый метилен и повторяют
экстракцию в ультразвуковой ванне еще 10 мин. Экстракт
отфильтровывают. Объединенный фильтрат помещают в делительную
воронку на 500 мл и производят очистку по п. 2.6.2.
Виноградный сок. 50 мл сока помещают в плоскодонную колбу на
250 мл, добавляют 70 мл смеси ацетон-хлористый метилен (1:1) и
затем 10 мл 1 М раствора NaOH (до рН 8 - 9). Колбу помещают в
ультразвуковую ванну и экстрагируют спироксамин в течение 10 мин.
Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку на 500 мл,
дают жидкости полностью расслоиться и нижнюю органическую фазу
сливают в круглодонную колбу через слой безводного сернокислого
натрия (30 г). С верхним водно-щелочным слоем (рН 8 - 9) повторяют
экстракцию 50 мл той же смеси ацетон-хлористый метилен (1:1) в
течение 10 мин. в ультразвуковой ванне. После расслоения жидкостей
в делительной воронке нижний органический слой сливают в ту же
круглодонную колбу через слой безводного сернокислого натрия,
который затем промывают 10 мл той же смеси. Водно-щелочной слой
отбрасывают. Объединенный органический экстракт упаривают досуха
на ротационном испарителе при температуре не выше 30 -С. Сухой
остаток растворяют в 1 мл ацетона. Дополнительная очистка на
колонке с флорисилом осуществляется так же, как для ягод винограда
или используют патроны Диапак С16 (п. 2.6.4).
2.6.2. Очистка экстрактов
Почва. Экстракт подщелачивают 1 н NaOH до рН 7,5 - 8,5 и
помещают в делительную воронку на 500 мл. Колбу ополаскивают 30 мл
хлороформа, который также переливают в делительную воронку.
Воронку встряхивают 2 мин., дают разделиться слоям. После полного
разделения слоев хлороформ (нижний слой) сливают в круглодонную
колбу на 250 мл, фильтруя через фильтр "белая лента" со слоем
безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще дважды,
каждый раз используя по 30 мл хлороформа. Фильтр с сульфатом
натрия промывают 20 мл хлороформа. Водный слой отбрасывают.
Объединенный экстракт выпаривают досуха на вакуумном ротационном
испарителе при температуре бани не выше 40 -С. Сухой остаток
растворяют в 2 - 3 мл этилового спирта и выпаривают досуха на
вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 -С.
Операцию с этанолом повторяют еще дважды. Далее проводят очистку
экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.
Зерно, зеленая масса и солома. После охлаждения до комнатной
температуры в колбу к экстракту добавляют 50 мл 0,1 М КН РО .
2 4
Содержимое колбы тщательно перемешивают в течение 3 - 5 мин.
Раствор фильтруют через фильтр "синяя лента" в коническую колбу
емкостью 200 мл. Колбу и осадок на фильтре промывают 50 мл 0,1 М
КН РО . Фильтрат подщелачивают 1 н раствором NaOH до рН 7,5 - 8,5.
2 4
Время от добавления к экстракту раствора КН РО до подщелачивания
2 4
не должно превышать 90 мин. После подщелачивания к раствору
приливают 30 мл хлороформа, встряхивают в течение 2 мин. и
переносят в делительную воронку. Слой хлороформа пропускают через
фильтр с сульфатом натрия (2 - 3 г) в круглодонную колбу на 250
мл. Экстракцию хлороформом повторяют еще 2 раза. Фильтр промывают
20 мл хлороформа. Фракции хлороформа объединяют, отгоняют на
вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 40 -С. Сухой
остаток растворяют в 2 - 3 мл этилового спирта и упаривают досуха
на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани 40 -С.
Операцию с этанолом повторяют дважды. Сухой остаток растворяют в
1 - 2 мл ацетона и хроматографируют по п. 2.7.1.
При наличии на хроматограммах проб мешающих определению
коэкстрактивных соединений проводят дополнительную очистку
экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.
Виноград. В делительную воронку с объединенным фильтратом
добавляют 40 - 50 мл 0,25 М раствора NaOH (до рН 8 - 9). Воронку
встряхивают в течение 3 мин. Нижнюю органическую фазу сливают
через слой безводного сернокислого натрия (30 г) в круглодонную
колбу. Верхний водный слой (рН 8 - 9) экстрагируют 50 мл
хлористого метилена, встряхивая воронку в течение 3 мин. После
полного расслоения жидкостей, органическую фазу сливают в ту же
круглодонную колбу через слой безводного сернокислого натрия (30
г). Водный слой отбрасывают, а объединенный органический экстракт
выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не
выше 30 -С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и далее
проводят очистку на колонке с флорисилом по п. 2.6.3.
2.6.3. Очистка экстрактов на колонке с окисью алюминия и
флористом
Вода, почва, зеленая масса, солома, зерно. Растворяют сухой
остаток в 1 мл ацетона. Перед внесением пробы уровень растворителя
в колонке понижают почти до верхнего края сорбента. Пипеткой
количественно вносят анализируемую пробу в колонку и дают ей
впитаться. Обмывают стенки колбы 1 мл ацетона, который также
вносят в колонку. Дают пробе впитаться, приоткрывая кран колонки и
внимательно следя за тем, чтобы уровень жидкости в колонке не
опускался ниже верхнего слоя сорбента. Элюируют спироксамин из
колонки, используя 40 мл этилацетата со скоростью 2 мл/мин. Первые
10 мл элюата отбрасывают, а последующие 30 мл собирают в
круглодонную колбу на 100 мл. Растворитель выпаривают досуха на
вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40
-С. Экстракт растворяют в 1 - 2 мл ацетона и хроматографируют по
п. 2.6.1.
Виноград (ягоды, сок). Ацетоновый раствор количественно
переносят в колонку с флорисилом. Стенки колбы обмывают 1 мл
ацетона и также вносят в хроматографическую колонку. После
впитывания раствора флорисилом элюируют спироксамин из колонки,
используя 50 мл смеси ацетон-гексан в соотношении 7:3. Первые 10
мл элюата отбрасывают, а последующие 40 мл собирают в круглодонную
колбу на 100 мл. Растворитель выпаривают досуха на ротационном
испарителе при температуре не выше 30 -С. Сухой остаток растворяют
в 1 мл ацетона и хроматографируют, дозируя в хроматограф 1 - 2 мкл
раствора.
2.6.4. Альтернативный вариант очистки виноградного сока с
помощью патрона Диапак С16
К 50 мл виноградного сока добавляют по каплям 1 н раствор NaOH
до рН 9 (контроль по индикаторной бумаге). Затем виноградный сок
фильтруют в колбу на 100 мл через стеклянную воронку с ватным
тампоном, предварительно промытым ацетоном. Остаток с ваты смывают
5 мл ацетона. Объединенный фильтрат пропускают через
предварительно откондиционированный патрон Диапак С16 со скоростью
1 - 2 мл/мин. По окончании пропускания образца остаток раствора
выдувается с картриджа током азота в течение 30 мин. Элюируют
спироксамин с патрона 6 мл хлористого метилена, добавляя его
порциями по 1 мл. Необходимо, чтобы первая порция элюента
задержалась в патроне 1 - 2 мин. для установления равновесия в
системе и более полного извлечения спироксамина. Элюат упаривают
досуха при температуре не выше 30 -С. Сухой остаток растворяют в 1
мл ацетона и хроматографируют.
2.7. Условия хроматографирования
Газовый хроматограф, оснащенный термоионным детектором (Цвет
500, НР-5840, PYE UNICAM 204 или аналогичные). Газ-носитель -
гелий или азот высокой чистоты.
Газовый хроматограф Цвет-550М с термоионным детектором.
Колонка стеклянная 2 м х 3 мм, заполненная Хромосорбом W (0,200 -
0,250 мм) с 5% SP-2100 или хроматоном N-Super (0,16 - 0,20 мм) с
5% SE. Температура колонки 220 -С, испарителя 240 -С, детектора
390 -С. Скорость потока газа-носителя (гелий) - 37 мл/мин.,
водорода 20 мл/мин., воздуха 300 мл/мин. Шкала электрометра 2 х
9
10 . Время удерживания 5,0 +/- 0,1 мин. (изомер 1), 6,0 +/-
0,1 мин. (изомер 2). При скорости газа-носителя 51,5 мл/мин. и
температуре колонки 230 -С время удерживания спироксамина 2,64 +/-
0,05 мин. (изомер 1) и 3,25 +/- 0,05 мин. (изомер 2).
Условия хроматографирования для импортируемых хроматографов HP
5840 и PYE UNICAM 204 приведены в таблице:
---------------T-------------------------------------------------¬
¦Характеристика¦ Варианты ¦
¦ +------------T------------T-----------T-----------+
¦ ¦ I ¦ II ¦ III ¦ IV ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Носитель ¦хромосорб ¦хроматон ¦инертон ¦хромосорб ¦
¦ ¦750 ¦N-AW-DMCS ¦супер ¦750 ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Размер частиц,¦0,12 - 0,150¦0,2 - 0,25 ¦0,16 - 0,2 ¦0,12 - ¦
¦мм ¦ ¦ ¦ ¦0,150 ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Неподвижная ¦3% OV-17 ¦5% SE-30 ¦5% SE-30 ¦5% PS-400 ¦
¦фаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Длина колонки,¦1,8 ¦1,8 ¦1,5 ¦2 ¦
¦м ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Внутренний ¦2 ¦2 ¦2 ¦2 ¦
¦диаметр ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦колонки, мм ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Скорость пото-¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ка, мл/мин.: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦гелия или ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦азота ¦12,3 ¦16 ¦25 ¦30 ¦
¦водорода ¦3,4 ¦3,4 ¦35 ¦35 ¦
¦воздуха ¦60 ¦60 ¦350 ¦350 ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Температура, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦-С: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦колонки ¦190 ¦200 ¦210 ¦190 ¦
¦инжектора ¦250 ¦250 ¦250 ¦250 ¦
¦детектора ¦300 ¦300 ¦300 ¦300 ¦
+--------------+------------+------------+-----------+-----------+
¦Время удержи- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦вания, мин.: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦изомера I ¦10,7 +/- 0,5¦8,3 +/- 0,3 ¦7,5 +/- 0,3¦4,7 +/- 0,3¦
¦изомера II ¦12,9 +/- 0,5¦10,2 +/- 0,3¦8,8 +/- 0,3¦5,7 +/- 0,3¦
L--------------+------------+------------+-----------+------------
2.8. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной
градуировки, содержание спироксамина в пробах рассчитывают по
формуле:
C x V x V S S
1 1 2
X = ---------- х {-- + --},
1 V x P c c
2 S S
1 2
где:
Х - содержание спироксамина в пробе, мг/кг;
с с
S , S - площадь (высота) пика спироксамина в стандартном
1 2
растворе для изомеров 1 и 2, соответственно, мв х с (мм);
S , S - площадь (высота) пика спироксамина в анализируемой
1 2
пробе для изомеров 1 и 2, соответственно, мв x с (мм);
V - объем анализируемой пробы, мл;
Р - навеска анализируемого образца, г;
С - концентрация стандартного раствора спироксамина, мкг/мл;
V и V - дозируемые объемы стандартного и анализируемого
1 2
растворов, мкл.
Содержание остаточных количеств спироксамина в анализируемой
пробе вычисляют как среднее из 3 параллельных определений.
3. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования
инструкции "Основные правила безопасной работы в химической
лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с
органическими растворителями, токсичными веществами, сжатыми
газами, а также инструкций по эксплуатации газового хроматографа и
электрооборудования.
4. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений
осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ
"Внутренний контроль качества результатов количественного
химического анализа".
5. Разработчики
Определение спироксамина в воде, почве, зеленой массе, зерне и
соломе злаковых культур: Басова Ю.Г., Сабуров Г.Г., Андреева М.В.,
Маслаков С.Е. Санкт-Петербургский научно-исследовательский
институт лесного хозяйства.
Определение спироксамина в винограде: Остроухова О.К., Блинова
Т.Ф., Цибульская И.А., Долженко В.И. Всероссийский научно-
исследовательский институт защиты растений (ВИЗР).
|
