Право
Навигация

 

Реклама




 

 

Ресурсы в тему

 

Реклама

Секс все чаще заменяет квартплату

Новости законодательства Беларуси

 

СНГ Бизнес - Деловой Портал. Каталог. Новости

 

Рейтинг@Mail.ru


Законодательство Российской Федерации

Архив (обновление)

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА (ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.1.1912-04 (УТВ. ГЛАВНЫМ ГОСУДАРСТВЕННЫМ САНИТАРНЫМ ВРАЧОМ РФ 06.03.2004)

(по состоянию на 20 октября 2006 года)

<<< Назад


                                                             Утверждаю
                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                 Российской Федерации,
                                                    Первый заместитель
                                              Министра здравоохранения
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                     6 марта 2004 года
   
                                                       Дата введения -
                                                       1 мая 2004 года
   
               4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
                                   
             ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА
         (ХЛОРАМФЕНИКОЛА, ХЛОРМИЦЕТИНА) В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО
          ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ
               ХРОМАТОГРАФИИ И ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
                                   
                         МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
                            МУК 4.1.1912-04
   
       1.  Разработаны:  ГУ  НИИ  питания РАМН  (В.А.  Тутельян,  С.А.
   Хотимченко,  С.А.  Шевелева, В.К. Кирничная,  Т.В.  Киселева,  Н.Г.
   Орлова,  Н.Р.  Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным
   университетом  им.  М.В.  Ломоносова (А.М. Егоров,  А.Ю.  Колосова,
   Ж.В. Самсонова).
       2.  Рекомендованы  к утверждению Комиссией по  государственному
   санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.
       3.   Утверждены   Главным  государственным  санитарным   врачом
   Российской  Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения
   Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.
       4. Введены в действие 1 мая 2004 г.
       5. Введены впервые.
   
                  1. Назначение и область применения
   
       Настоящие  Методические указания предназначены  для  учреждений
   госсанэпидслужбы  Минздрава  РФ и других  ведомств,  осуществляющих
   контроль  качества  и  безопасности  продовольственного   сырья   и
   пищевых   продуктов   в   соответствии   с   СанПиН   2.3.2.1078-01
   "Гигиенические  требования безопасности и пищевой ценности  пищевых
   продуктов".
       Методические  указания распространяются на методы  с  различным
   целевым  назначением (арбитраж, скрининг). Два  метода  определения
   остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина)  в
   продуктах животного происхождения:
       I - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
       II - иммуноферментного анализа (ИФА).
   
                          2. Общие положения
   
       Среди    ряда    веществ,    которые   могут    контаминировать
   продовольственное сырье и пищевые продукты, важное  место  занимают
   ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных,  так
   и  в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными
   препаратами,  используемыми  в ветеринарии,  остаются  антибиотики.
   Известно   большое   число  антибиотиков,   обладающих   различными
   свойствами,  механизмом  и  спектром  действия,  распределением   в
   организме животных, характером метаболизма и т.д.
       Систематическое поступление в организм человека антибиотиков  с
   продуктами  питания  крайне вредно, поскольку они  могут  оказывать
   нежелательные    эффекты,   чаще   всего   в   виде   возникновения
   аллергических   реакций,   дисбактериозов,   подавлять   активность
   некоторых  ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать
   распространению  устойчивых  форм микроорганизмов  и  т.д.  Следует
   учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков  в  сырье
   для  пищевой  промышленности  на  проведение  ряда  технологических
   процессов  в  переработке  мяса, рыбы,  молока  (в  частности,  при
   получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме  того,
   наличие    антибиотиков    может   затруднять    бактериологические
   исследования качества продуктов животного происхождения.
       Хлорамфеникол  (далее  -  ХАФ) является  антибиотиком  широкого
   спектра   действия,  обладающим  высокой  активностью  в  отношении
   бактерий  и  риккетсий.  В  отличие  от  многих  антибиотиков   ХАФ
   обладает довольно простым химическим строением.
       Хлорамфеникол  малорастворим  в  воде,  но  хорошо  в   спирте.
   Установлено,  что  ХАФ медленно выводится из организма  животных  и
   сравнительно   долго   сохраняет  свою  активность   при   хранении
   продуктов.
       В  настоящее  время  для определения ХАФ  в  продуктах  питания
   применяют  ряд  методов,  в  их  числе  микробиологические  методы,
   которые   являются   сравнительно  простыми  и   дешевыми,   однако
   отличаются   недостаточной  специфичностью   и   воспроизводимостью
   результатов.
       Для   арбитражных   исследований  вводятся   хроматографические
   методы,  в  частности  ВЭЖХ, позволяющий раздельно  определять  как
   ХАФ, так и его метаболиты.
       Количественный    метод    определения    ХАФ    при     помощи
   высокоэффективной  жидкостной хроматографии в  сельскохозяйственных
   продуктах  отличается  низким пределом  обнаружения  (0,01  мг/кг),
   хорошей  воспроизводимостью (относительное  стандартное  отклонение
   0,15 - 0,21) и надежностью.
       Для   скрининговых   целей  в  мире  широко  применяют   методы
   иммунохимического       анализа,       обеспечивающие       высокую
   чувствительность,  специфичность и точность. Для  контроля  пищевой
   продукции     предпочтение    отдается    методам     твердофазного
   иммуноферментного  анализа, которые являются  высокочувствительными
   (предел обнаружения - 0,00008 мг/кг).
       Методические    указания    предназначены    для     учреждений
   госсанэпидслужбы  Минздрава  РФ и других  ведомств,  осуществляющих
   контроль  качества  и  безопасности  продовольственного   сырья   и
   пищевых   продуктов.   Согласно  СанПиН  2.3.2.1078-01   содержание
   левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.
   
                      3. Отбор и подготовка проб
   
       Отбор   и   подготовка  проб  аналогичны  для   обоих   методов
   исследования.
       Отбор   продуктов  питания  осуществляется  в  соответствии   с
   требованиями  ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79  "Мясо",
   ГОСТ  7202.0-74  "Мясо  птицы", ГОСТ  3622-68  "Молоко  и  молочные
   продукты".
       Отобранные   образцы   продуктов   герметично   упаковывают   в
   полиэтиленовые  мешки, стеклянные банки с притертыми  крышками  или
   укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для  анализа
   сразу  же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят  на
   холоде,  а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание
   -4   -   -10   -С,   используя  для  этой  цели  холодильники   или
   соответствующие приспособления.
       К  исследованию скоропортящихся образцов следует  приступать  в
   день  их  доставки в лабораторию. При отсутствии такой  возможности
   образцы  должны  хранить при указанной выше  температуре  не  более
   двух недель со времени отбора среднего образца.
   
                  4. Определение остаточных количеств
              левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина)
              в продуктах животного происхождения методом
              высокоэффективной жидкостной хроматографии
   
                          4.1. Принцип метода
   
       Метод   основан   на   извлечении  хлорамфеникола   экстракцией
   этилацетатом,  последовательной  промывке  экстракта   разбавленным
   раствором  щелочи  и  кислоты, обезжиривании петролейным  эфиром  и
   хроматографическом    разделении   с   помощью    высокоэффективной
   жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.
   
                 4.2. Аппаратура, материалы, реактивы
   
       Жидкостный хроматограф с УФ детектором,
       длина волны 278 нм, любой марки
       Колонка с обращенной фазой (ODS, С18) длина
       25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм
       Гомогенизатор тканей                           ГОСТ 15906
       Центрифуга настольная
       или аналогичная                                ТУ 5.375-4261
       Ротационный испаритель с ловушкой              ТУ 25-11-917
       Азот, поверочный нулевой газ                   ГОСТ 9293-74
       Весы технические                               ГОСТ 19491
       Весы аналитические                             ГОСТ 24104-88Е
       Цилиндры мерные, объемом 50 и 100 куб. см      ГОСТ 1770
       Колбы плоскодонные на 50 и 100 куб. см
       НШ N 14,5                                      ТУ 48-52
       Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см           ГОСТ 1770
       Пипетки 1,0, 2,0, 5 и 10 куб. см               ГОСТ 29227-91
       Колбы для упаривания с круглым или
       коническим дном на 50 и 100 куб. см с НШ
       N 14,5                                         ГОСТ 10394
       Воронка делительная на 100 куб. см             ГОСТ 2536
       Натрий серно-кислый, безводный                 ГОСТ 4166
       Этилацетат, хч                                 ГОСТ 5.1070
       Натрий хлористый, насыщенный раствор в воде    ГОСТ 4233
       Гидроокись натрия, хч
       10%-ный раствор щелочи (NaOH, КОН)
       Уксусная кислота                               ГОСТ 61-75
       10%-ный раствор уксусной кислоты
       Серная кислота                                 ГОСТ 14262-78
       Калий фосфорно-кислый однозамещенный
       0,025 М раствор КН РО                          ТУ 6-09-5324-87
                         2  4
       Ацетонитрил                                    ТУ 6-09-3534
       Петролейный эфир, фракция 40 - 70 -С
       Метанол (спирт метиловый)
       Дециламин, импорт.                             ГОСТ 6995-77
       Вода дистиллированная                          ГОСТ 6709
       Левомицетина сукцинат растворимый
   
                 4.3. Требования техники безопасности
                       при проведении испытаний
   
       Помещение,  в  котором  проводится определение  хлорамфеникола,
   должно   быть   оборудовано  приточно-вытяжной   вентиляцией.   Все
   операции   анализа   необходимо  проводить  в  вытяжном   шкафу   с
   использованием индивидуальных средств защиты.
   
                      4.4. Подготовка к испытанию
   
       4.4.1. Приготовление растворов
       Взвешивают  25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу  на  25
   куб.  см  и  растворяют  в  метаноле, концентрация  левомицетина  1
   мг/мл.  В  мерную  колбу  на  25 куб.  см  помещают  0,25  куб.  см
   полученного  раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация
   левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
   
                4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ
   
       4.5.1.  Подготовка  образца  для  определения  левомицетина  в
   молоке
       Смешивают  25 куб. см молока с 12 г безводного сульфата натрия
   и  экстрагируют  (3  раза  по  15 куб. см этилацетата). Полученную
   смесь   центрифугируют   15  мин.  со  скоростью  4000  об./мин. и
   декантируют.  Этилацетатный  слой промывают последовательно 5 куб.
   см  насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 куб. см 10%
   NaOH;  5  куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 куб.
   см  10% СН СООН; 5 куб. см насыщенного раствора NaCl. Органический
             3
   слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 -С) до
   возможно  минимального  объема,  отдувают  азотом  до исчезновения
   запаха  органических  растворителей,  добавляют  3  куб.  см смеси
   ацетонитрил-вода  (1:4)  и  экстрагируют  3  раза  по  5  куб.  см
   петролейным  эфиром.  Петролейный  эфир  отбрасывают  и  извлекают
   левомицетин  экстракцией  этилацетатом  (3  раза  по  5  куб. см).
   Этилацетатный  слой  упаривают  досуха,  растворяют  в 0,1 куб. см
   метанола.
       4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе
       Гомогенизируют 10 г мяса с 15 куб. см фосфатного буфера (0,025
   М КН РО  + 0,025 М Na HPO ) рН = 6,88 и экстрагируют 3 раза по  30
       2  4             2   4
   куб. см  этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин. при
   4000  об./мин.   и   декантируют   этилацетатный  слой,  промывают
   последовательно  5 куб. см насыщенного раствора NaCl с добавлением
   0,2 мл 10%-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением
   0,2 мл  10%-ного  СН СООН и  5  куб. см насыщенного раствора NaCl.
                       3
   Органический  слой  отбирают и упаривают на ротационном испарителе
   (при  50  -С)  до возможно минимального объема, отдувают азотом до
   исчезновения  запаха  органических растворителей, добавляют 3 куб.
   см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 куб. см
   петролейного  эфира,  петролейный  эфир  отбрасывают  и  извлекают
   левомицетин  экстракцией  этилацетатом  (3  раза  по  5  куб. см).
   Этилацетатный  слой  упаривают  досуха,  растворяют  в 0,1 куб. см
   метанола.
       4.5.3. Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах
       Перетирают 10 г гомогената яйца с  5 г  Na SO ,  приливают  40
                                                 2  4
   куб.  см  этилацетата  и  5  куб.  см  1Н H SO ,  перемешивают   и
                                              2  4
   центрифугируют 5 - 10 мин. при 4000 об./мин.,  этилацетатный  слой
   декантируют, водную часть экстрагируют  последовательно  30  и  20
   куб. см этилацетата, при необходимости применяя  центрифугирование
   для расслоения.  Объединенные   этилацетатные    слои    промывают
   последовательно    10   куб. см   2-процентного   раствора  Na CO
                                                                 2  3
   насыщенного  NaCl; 10 куб. см насыщенного раствором NaCl.
   
                4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)
   
       В  жидкостной  хроматограф  с колонкой (Ультрасфер ODS, С  ) 5
                                                                18
   мкм (250  х  4,6 мм), УФ детектором при лямбда = 278 нм, используя
   элюент   ацетонитрил-вода-дециламин   (40:60:0,1),  вводят   5 мкл
   стандартного  раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях
   вводят метанольный экстракт образца (молока, мяса, яиц).
   
          4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах
   
       Для  подтверждения наличия левомицетина к 50  мкл  метанольного
   экстракта  приливают 50 мкл 10%-ного раствора КОН  и  нагревают  20
   мин.  при  70  -С,  10 мкл полученного раствора  вводят  в  тех  же
   условиях   в   колонку  жидкостного  хроматографа.  На   полученной
   хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина  отсутствует.
   Это подтверждает наличие левомицетина в образце.
   
                      4.8. Обработка результатов
   
       4.8.1.  За окончательный результат измерения принимают  среднее
   арифметическое    результатов   двух   параллельных    определений.
   Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
   
                                                             Таблица 1
   
           МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
      ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
                         (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
   
   --------------------------------------T--------------------------¬
   ¦        Статистический параметр      ¦Соединение - хлорамфеникол¦
   +-------------------------------------+--------------------------+
   ¦Нижний предел определения, мг/кг     ¦0,01                      ¦
   +-------------------------------------+--------------------------+
   ¦Интервал надежного определения, мг/кг¦0,01 - 10,0               ¦
   +-------------------------------------+--------------------------+
   ¦Среднее значение открываемости       ¦95,5                      ¦
   ¦(показатель правильности), %         ¦                          ¦
   +-------------------------------------+--------------------------+
   ¦Допустимое расхождение между резуль- ¦7,0                       ¦
   ¦татами двух параллельных определений ¦                          ¦
   ¦хлорамфеникола, полученными в одной  ¦                          ¦
   ¦лаборатории в одной серии измерений  ¦                          ¦
   ¦(сходимость), при Р = 0,95% не должно¦                          ¦
   ¦превышать, %                         ¦                          ¦
   +-------------------------------------+--------------------------+
   ¦Допустимое расхождение между резуль- ¦10,0                      ¦
   ¦татами двух параллельных определений ¦                          ¦
   ¦хлорамфеникола, выполненных в двух   ¦                          ¦
   ¦разных лабораториях (воспроизводи-   ¦                          ¦
   ¦мость), при Р = 0,95% не должно пре- ¦                          ¦
   ¦вышать по отношению к среднему, %    ¦                          ¦
   L-------------------------------------+---------------------------
   
       4.8.2.   Если   расхождение   результатов   двух   параллельных
   определений  (сходимость и воспроизводимость) превышает  требования
   по   п.   4.8.1,   то  повторно  проводят  два  новых  параллельных
   определения.
   
             5. Определение хлорамфеникола (левомицетина)
          в продуктах животного происхождения (молоке, мясе,
               яйцах) методом иммуноферментного анализа
   
                        5.1. Принцип метода ИФА
   
       В  основу  метода количественного определения ХАФ  в  продуктах
   питания   положен  принцип  твердофазного  конкурентного   ИФА   на
   полистироловых  планшетах. Принцип метода  основан  на  конкуренции
   свободного   ХАФ   из   измеряемой  пробы  и  ХАФ,   предварительно
   иммобилизованного  на  твердой фазе в составе белкового  конъюгата,
   за  центры  связывания специфичных к ХАФ антител.  После  отделения
   несвязавшихся  реагентов  количество  антител,  прореагировавших  с
   иммобилизованным   антигеном,  определяют  с  помощью   антивидовых
   антител,  меченных  пероксидазой хрена. Количество  связавшегося  с
   антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-
   хромогенной    смеси.    Количество   определяемого    антибиотика,
   содержащегося   в   исследуемом  образце,  обратно  пропорционально
   регистрируемой   оптической   плотности   продукта   ферментативной
   реакции.
       Пределы обнаружения метода - 0,000012 - 0,00008 мг/кг.
   
                 5.2. Аппаратура, материалы, реактивы
   
       Фотометр планшетный вертикального
       сканирования с фильтрами, соответствующими
       длине волны 492 или 450 нм "Униплан",
       "Пикон", "Мультискан",
       или иного типа с теми же характеристиками
       Дозаторы пипеточные автоматические с пере-
       менным объемом 0,002 - 0,02 куб. см,
       0,02 - 0,2 куб. см, 0,1 - 1 куб. см
       одноканальные "Ленпипет",
       "Термолабсистемс" или иные тех же объемов
       Дозаторы пипеточные автоматические 8-каналь-
       ные с переменным объемом 0,05 - 0,3 куб. см
       "Ленпипет", "Термолабсистемс"
       или иные тех же объемов
       Наконечники для автоматических пипеток объе-
       мом 0,3 и 1,0 куб. см однократного применения
       Анализатор потенциометрический, погрешность
       измерений рН +/- 0,01 или рН-метр                ГОСТ 19881-74
       или другие марки с аналогичными
       характеристиками
       Весы аналитические 120 г/0,001 мг
       Весы лабораторные общего назначения, 2 класса
       точности, до 200 г/0,1 г                         ГОСТ 24104-88
       Термостат, позволяющий поддерживать рабочую
       температуру 37 -С с отклонением от заданной
       +/- 1 -С, не более                             ТУ 64-1-1382-72
       Гомогенизатор лабораторный перистальтический
       типа "Стомайкер", "Микс-2"
       или других наименований
       Аквадистиллятор, обеспечивающий качество
       дистиллированной воды                             ГОСТ 6709-72
       Холодильник бытовой электрический                ГОСТ 16317-87
       Стаканы химические и колбы мерные,
       вместимостью 25, 50, 200 и 500 куб. см            ГОСТ 1170-74
       Часы механические сигнальные                      ГОСТ 3145-84
       Центрифуга настольная со скоростью не менее
       4000 об./мин. (3000 g)                           ТУ 5.375-4261
       или иного типа
       Цилиндры мерные, вместимостью 25 куб. см
       Шейкер лабораторный для пробирок
       типа "Вортекс"
       Микроиспаритель лабораторный одноканальный
       моделей ПЭ-2300, "Мини-Вак"
       или других аналогичного назначения
       Насос (компрессор) мембранный РКадет,
       РКадмирал или иных моделей аналогичного
       назначения
       Аппарат универсальный для встряхивания         ТУ 64-1-2451-78
       Набор реагентов для количественного
       определения хлорамфеникола (левомицетина)
       методом иммуноферментного анализа типа
       "ИФА-ХАФ" (производства ЗАО "НВО Имму-
       нотех") или другие с аналогичными
       характеристиками
       Набор реагентов для количественного определе-
       ния хлорамфеникола (левомицетина) типа
       "Ридаскрин Левомицетин" (производства
       "Р-Биофарм АГ") или другие с аналогичными
       характеристиками
       Калий железистосинеродистый (желтая кровяная
       соль), хч
       Цинка сульфат, хч
       Этилацетат, хч                                     ГОСТ 5.1070
       Хлороформ технический                          ГОСТ 2-15-76-72
       Изооктан, хч
   
           5.3. Характеристика наборов для иммуноферментного
               определения левомицетина (хлорамфеникола)
   
       5.3.1. Состав набора ИФА-ХАФ:
       - планшет 96-луночный полистироловый,
       покрытый конъюгатом ХАФ-овальбумин                      1 шт.;
       - раствор ХАФ в метаноле концентрацией 1 мг/куб. см     1 фл.;
       - антитела против ХАФ в 1%-ном растворе
       сахарозы, лиофилизированные                             1 фл.;
       - конъюгат вторичных антител с пероксидазой
       из корня хрена                                          1 фл.;
       - фосфатно-солевой буфер, приготовленный
       на основе одно- и двухзамещенного фосфата
       калия с добавлением твин-20, рН 7,0 +/- 0,5,
       концентрированный                                       2 фл.;
       - буфер для анализа образцов молока,
       приготовленный с добавлением казеина и
       азида натрия, концентрированный - буфер 1               1 фл.;
       - субстратный буфер, приготовленный на основе
       лимонной кислоты, натриевой соли лимонной
       кислоты и перекиси водорода, рН 4,9 +/- 0,3,
       концентрированный                                       1 фл.;
       - о-фенилендиамин (хромоген), по 6 мг                 1 табл.;
       - серная кислота (стоп-реагент), 25%                     1 фл.
       5.3.2. Состав набора "Ридаскрин Левомицетин"
       Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8  лунок),
   сенсибилизированных антителами "захвата" - 1 шт.
       Комплект   стандартных  растворов  левомицетина  со  следующими
   концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/куб. см в  буферном
   растворе по 1,3 мл - 6 шт.
       Конъюгат левомицетина с пероксидазой - 0,7 куб. см.
       Антитела к левомицетину - 0,7 куб. см.
       Субстрат, содержит пероксид карбамида - 7 куб. см.
       Хромоген, содержит тетраметилбензидин - 7 куб. см.
       Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту - 14 куб. см.
       Буфер  1,  для  разбавления стандартных растворов левомицетина,
   конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2 - 100 куб. см.
       Буфер  2,  для  разбавления стандартных  образцов  при  анализе
   молока - 1 куб. см.
       Наборы  рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях  41
   исследуемого  образца и 6 калибровочных проб (всего 96  определений
   на один планшет).
       5.3.3. Аналитические характеристики наборов
       5.3.3.1. Набор ИФА-ХАФ
       Специфичность.  Использование высоко  аффинных  антител  к  ХАФ
   обеспечивает  высокую  специфичность анализа. Процент  перекрестной
   реакции  с  сукцинатом ХАФ составляет 25%, с дезацилированным  ХАФ,
   являющимся  одним  из  метаболитов  антибиотика,  -  менее  1%,   с
   антибиотиками других групп - менее 1%.
       Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая  с
   помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (куб. дм).
       Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений
   концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12%.
       Тест на открытие. Процент открытия составляет 70 - 130%.
       Линейность. Линейность составляет 90 - 110%.
       Диапазон  определяемых концентраций 0,0001 -  0,1  мг/кг  (куб.
   дм).
       Проверка  набора.  При  параллельном  определении  концентрации
   хлорамфеникола  в  продуктах  питания  животного  происхождения   с
   помощью   набора  ИФА-ХАФ  и  метода  ВЭЖХ  коэффициент  корреляции
   составляет 0,975.
       5.3.3.2. Набор "Ридаскрин Левомицетин"
       Чувствительность  (пределы обнаружения) -  0,000012  -  0,00005
   мг/кг (куб. дм).
       Извлекаемость - > 80%.
       Перекрестная чувствительность: левомицетин - 100%,  левомицетин
   основной - 0,5%, тиамфеникол - менее 0,05%. Нет чувствительности  к
   тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.
   
                 5.4. Требования техники безопасности
                       при проведении испытаний
   
       Все  компоненты  наборов,  за исключением  о-фенилендиамина,  в
   используемых  концентрациях не токсичны.  О-фенилендиамин  обладает
   канцерогенным  действием. Поэтому в случае  попадания  вещества  на
   кожные  или  слизистые покровы следует немедленно  тщательно  смыть
   его   большим  количеством  воды.  Стоп-реагент  содержит  в  своем
   составе  серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента  с
   кожей.
   
        5.5. Проведение испытаний с применением набора ИФА-ХАФ
   
       Все  разведения реагентов и расчеты представлены для проведения
   анализа на 1 планшете.
       Построение   калибровочной  кривой  необходимо  проводить   для
   каждого планшета.
       5.5.1. Приготовление реагентов
       5.5.1.1.  Приготовление фосфатно-солевого  буфера,  содержащего
   детергент (ФСБТ)
       Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным  раствором
   количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора  до
   400   куб.  см  дистиллированной  водой.  Полученный  буфер   может
   храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2  -  8
   -С.
       5.5.1.2. Приготовление буфера 1
       Содержимое   флакона   с   концентратом  буфера   количественно
   перенести  в стакан и довести общий объем раствора до  50  куб.  см
   ФСБТ.  Полученный  буфер  может храниться  в  течение  5  дней  при
   температуре 2 - 8 -С.
       5.5.1.3. Приготовление образцов для анализа
       Молоко.  Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером
   1.
       Мясо.  Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6  куб.  см
   этилацетата  в течение 5 мин., затем центрифугируют  в  течение  10
   мин.  Упаривают досуха 1 куб. см верхней фазы. Осадок  перемешивают
   с  3  куб.  см  ФСБТ и центрифугируют при 3000 g в течение  5  мин.
   Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.
       Яйца.   Взвешивают  по  3  г  смешанного  (гомогенизированного)
   содержимого  яйца  в  реакционную  посуду  и  проводят   дальнейшую
   пробоподготовку, как описано для образцов мяса.
       5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)
       Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.
       Молоко.  Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора
   ХАФ в метаноле (1 мг/куб. см) по следующей схеме.
       1.  Приготовить  5 куб. см раствора ХАФ в ФСБТ с  концентрацией
   0,01  мг/куб.  см  (5  куб.  см  раствора  содержат  0,05  куб.  см
   стандартного раствора ХАФ в метаноле).
       2.  Приготовить 1 куб. см калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере
   1  с концентрацией 100 нг/куб. см (1 куб. см раствора содержит 0,01
   куб. см раствора, приготовленного на стадии 1).
       3.  Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП 6  с
   использованием буфера 1:
   
   -----T-------------T--------------T------------------------------¬
   ¦ N  ¦Концентрация ¦ Общий объем  ¦  Объем КП 6, содержащийся в  ¦
   ¦    ¦ХАФ, нг/куб. ¦калибровочной ¦соответствующей калибровочной ¦
   ¦    ¦     см      ¦пробы, куб. см¦        пробе, куб. см        ¦
   +----+-------------+--------------+------------------------------+
   ¦КП 1¦0            ¦1,0           ¦0                             ¦
   +----+-------------+--------------+------------------------------+
   ¦КП 2¦0,1          ¦0,5           ¦0,1 куб. см из КП 3           ¦
   +----+-------------+--------------+------------------------------+
   ¦КП 3¦0,5          ¦1,0           ¦0,005                         ¦
   +----+-------------+--------------+------------------------------+
   ¦КП 4¦2            ¦1,0           ¦0,02                          ¦
   +----+-------------+--------------+------------------------------+
   ¦КП 5¦10           ¦1,0           ¦0,1                           ¦
   L----+-------------+--------------+-------------------------------
   
       Мясо  (яйца).  Калибровочные пробы  готовятся  из  стандартного
   раствора  ХАФ  в метаноле (1 мг/куб. см) по вышеприведенной  схеме.
   На всех стадиях используется буфер ФСБТ.
       5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител
       Рабочий   раствор   антител  готовится  непосредственно   перед
   использованием.
       Содержимое   одного  флакона  с  лиофилизированными  антителами
   растворить  в  6  куб.  см  ФСБТ. Полученный  раствор  хранению  не
   подлежит.
       5.5.1.6. Приготовление рабочего раствора конъюгата
       Рабочий  раствор  конъюгата  готовится  непосредственно   перед
   использованием.
       Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно  перенести
   в  стакан  и  довести общий объем до 15 куб. см ФСБТ - при  анализе
   образцов молока и до 30 куб. см - при анализе образцов мяса и  яиц.
   Полученный раствор хранению не подлежит.
       5.5.1.7. Приготовление субстратно-хромогенной смеси
       Субстратно-хромогенную  смесь  готовят  непосредственно   перед
   использованием.
       Для  приготовления раствора применять только  химически  чистую
   посуду.
       В  11,25 куб. см дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-
   фенилендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света.  К
   полученному   раствору   количественно  добавить   1,25   куб.   см
   концентрата    субстратного   буферного    раствора.    Субстратно-
   хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.
       5.5.2. Процедура анализа
       Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:
   
   --------T------T-------T------T-------T--------------------T-----¬
   ¦       ¦  1   ¦   2   ¦  3   ¦   4   ¦                    ¦ 12  ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦А      ¦КП1   ¦КП1    ¦П3    ¦П3     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦В      ¦КП2   ¦КП2    ¦П4    ¦П4     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦С      ¦КП3   ¦КП3    ¦П5    ¦П5     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦D      ¦КП4   ¦КП4    ¦П6    ¦П6     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦Е      ¦КП5   ¦КП5    ¦П7    ¦П7     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦F      ¦КП6   ¦КП6    ¦П8    ¦П8     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦G      ¦П1    ¦П1     ¦П9    ¦П9     ¦                    ¦П    ¦
   +-------+------+-------+------+-------+--------------------+-----+
   ¦Н      ¦П2    ¦П2     ¦П10   ¦П10    ¦                    ¦П    ¦
   L-------+------+-------+------+-------+--------------------+------
   
       5.5.2.1.  В два ряда лунок планшета внести калибровочные  пробы
   (КП),  приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05  куб.  см,  начиная  с
   минимальной  концентрации. Рекомендуется не  вносить  калибровочные
   пробы  в  крайние  ряды  планшета  во  избежание  влияния  краевого
   эффекта.  При  разнице  более 0,1 единицы  оптической  плотности  в
   результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать  результат
   крайнего ряда не следует.
       В  оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые  образцы  в
   объеме 0,05 куб. см.
       Процедуру   внесения  образцов  следует  выполнять  как   можно
   быстрее. Вся операция не должна превышать 12 - 15 мин.
       5.5.2.2.  Во все лунки планшета внести по 0,05 куб. см рабочего
   раствора  антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела  вносить
   в  лунки  планшета в той же последовательности, что и калибровочные
   пробы и исследуемые образцы.
       5.5.2.3.  Плотно  закрыть  планшет  крышкой  и  выдержать   при
   температуре 37 -С в течение 1,5 ч в термостате.
       5.5.2.4.  Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести
   отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35  куб.  см
   промывочного  буферного раствора, оставить на 1 - 2 мин.,  а  затем
   удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4  раза.
   После  этого  тщательно удалить остатки влаги из  лунок,  несколько
   раз  вытряхнув  планшет  о  марлевую  салфетку  или  фильтровальную
   бумагу.
       5.5.2.5.  Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см  рабочего
   раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.
       5.5.2.6.  Плотно  закрыть  планшет  крышкой  и  выдержать   при
   температуре 37 -С в течение 1 ч в термостате.
       5.5.2.7.  Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести
   отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35  куб.  см
   промывочного  буферного раствора, оставить на 1 - 2 мин.,  а  затем
   удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить  5  раз.
   После  этого  тщательно удалить остатки влаги из  лунок,  несколько
   раз  вытряхнув  планшет  о  марлевую  салфетку  или  фильтровальную
   бумагу.
       5.5.2.8.  Во все лунки планшета внести по 0,1 куб. см  раствора
   субстратно-хромогенной  смеси  и выдержать  планшет  при  комнатной
   температуре  18 - 25 -С в темном месте в течение 30 - 35  мин.  при
   анализе  образцов молока и 7 - 10 мин. - при анализе образцов  мяса
   или яиц.
       5.5.2.9.  Внести во все лунки планшета по 0,35  куб.  см  стоп-
   реагента (раствора серной кислоты).
       5.5.2.10.  Измерить оптическую плотность в лунках планшета  при
   длине  волны  490 нм. Окраска планшета стабильна в течение  1  ч  в
   темноте.
       5.5.3. Учет результатов
       Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности
   от  концентрации  ХАФ в калибровочных пробах (следует  использовать
   логарифмический  масштаб  для оси абсцисс).  Соединить  кривой  (по
   лекалу)  полученные  точки. Образец калибровочной  кривой  приведен
   ниже (не приводится).
       Рассчитать    средние   арифметические   значения   показателей
   оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной  кривой
   определить  в  них  концентрацию ХАФ, учитывая фактор  разбавления,
   который равен 100, для всех образцов.
       5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора
       Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2 -  8
   -С  в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при
   температуре  до 25 -С не более 5 суток. Срок годности набора  -  12
   мес.  Компоненты  набора перед использованием необходимо  выдержать
   при  комнатной  температуре 18 - 25 -С не  менее  30  мин.  Раствор
   антител,  конъюгата  и  субстратно-хромогенная  смесь  хранению  не
   подлежат.  Промывочный  буферный  раствор  может  храниться   после
   разведения при температуре 2 - 8 -С в течение 5 дней. При  вскрытии
   и   растворении  лиофилизированных  компонентов  набора  необходимо
   следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.
   
            5.6. Проведение испытаний с применением набора
                        "Ридаскрин Левомицетин"
   
       5.6.1. Подготовка проб
       Образцы,  предназначенные  для  анализа,  должны  храниться   в
   холодильнике, в темном месте.
       5.6.1.1. Молоко
       Пробу  молока объемом 5 куб. см охладить до 8 -С,  перенести  в
   стеклянную центрифужную пробирку, центрифугировать при 4 - 12 -С  в
   течение  15 мин. при 3000 g. Удалить верхний слой жира и  перенести
   аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Для  анализа
   использовать  0,05  куб.  см раствора на 1 лунку  планшета.  Фактор
   разбавления  -  1.  Предел  обнаружения  -  0,00005  мг/кг.  Предел
   количественного обнаружения - 0,00015 мг/кг.
       Примечание:   для  приготовления  стандартных   растворов   для
   измерения проб молока использовать буфер 2.
   
       5.6.1.2. Исследования сухого молока
       Приготовить растворы:
       - осадителя 1 - 0,36 М раствор  ферроцианида (II) калия х 3Н О
                                                                   2
   - 1,52 г растворить в 10 куб. см дистиллированной воды;
       - осадителя 2 - 1,04 М раствор сульфата цинка х 7Н О  -  (2,99
                                                         2
   г растворить в 10 куб. см дистиллированной воды).
       Взвесить в центрифужной стеклянной пробирке 2 г сухого  молока,
   добавить  10  куб. см дистиллированной воды и встряхивать  пробирку
   до растворения пробы. Добавить в пробирку по 1 куб. см осадителя  1
   и   осадителя   2.  Пробы  тщательно  перемешать  на   вортексе   и
   центрифугировать при 4 - 12 -С в течение 10 мин. при 3000 g.  Перед
   центрифугированием пробы охладить до 8 -С, перенести  3,6  куб.  см
   супернатанта  (что  соответствует 0,6 г  сухого  молока)  в  чистую
   пробирку.   Добавить   в   пробирку  6  куб.   см   этилацетата   и
   экстрагировать  встряхиванием в течение  10  мин.  Центрифугировать
   при  комнатной температуре (20 - 25 -С) в течение 10 мин. при  3000
   g.
       Перенести  4  куб. см эфирного экстракта (соответствует  0,4  г
   сухого  молока) в новую чистую пробирку и испарить экстракт  досуха
   при  60 -С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 0,4 куб.
   см  буфера  1  и  тщательно  перемешать на  вортексе.  Для  анализа
   используют 0,05 куб. см раствора на 1 лунку планшета.
       Фактор разбавления                               1
       Предел обнаружения                               0,00005 мг/кг
       Предел количественного определения               0,00015 мг/кг
       5.6.1.3. Мясо
       Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г в  гомогенизаторе.
   Взвесить   в  стеклянной  центрифужной  пробирке  3  г  гомогената,
   смешать  с  3 куб. см дистиллированной воды и добавить  6  куб.  см
   этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси "вверх-вниз"  в
   течение  10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре  (20  -
   25 -С) в течение 10 мин. при 3000 g.
       Перенести  4  куб.  см эфирного экстракта  (соответствует  2  г
   пробы)  в  новую  чистую  пробирку и испарить  экстракт  досуха  на
   микроиспарителе  при  60 -С в слабом токе азота.  Растворить  сухой
   остаток  в  1  куб. см смеси изооктана с хлороформом в  соотношении
   2:3  и  тщательно перемешать на вортексе. Добавить к  раствору  0,5
   куб. см буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение  1
   мин.  Центрифугировать при комнатной температуре (20  -  25  -С)  в
   течение 10 мин. при 3000 g или более высоком ускорении.
       Для  анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний
   слой <*>) на 1 лунку планшета.
   --------------------------------
       <*>  В  случае образования пены или геля в межфазовой зоне  при
   недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку  на  5  мин.  в
   водяную   баню   при   температуре  80   -С   и   затем   еще   раз
   центрифугировать.
   
       Фактор разбавления                             0,1
       Предел обнаружения                             0,0000125 мг/кг
       Предел количественного обнаружения             0,0000375 мг/кг
       5.6.1.4. Яйца
       Гомогенизировать  пробу  массой  не  менее  100  г   смешанного
   содержимого   яйца   в   гомогенизаторе.  Взвесить   в   стеклянной
   центрифужной  пробирке  2  г  гомогената,  смешать  с  12  куб.  см
   этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси "вверх-вниз"  в
   течение  10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре  (20  -
   25 -С) в течение 10 мин. при 3000 g.
       Перенести  6  куб.  см эфирного экстракта  (соответствует  1  г
   пробы)  в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха  при  60
   -С  в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 куб. см смеси
   изооктана  с  хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно  перемешать
   на вортексе.
       Добавить   к   раствору  1  куб.  см  буфера  1  и   интенсивно
   перемешивать  на  вортексе в течение одной минуты. Центрифугировать
   при  комнатной температуре (20 - 25 -С) в течение 10 мин. при  3000
   g или более высоком ускорении.
       Для  анализа использовать 0,05 куб. см раствора (водный верхний
   слой <*>) на лунку планшета.
   --------------------------------
       <*>  В  случае образования пены или геля в межфазной  зоне  при
   недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку  на  5  мин.  в
   водяную   баню   при   температуре  80   -С   и   затем   еще   раз
   отцентрифугировать.
   
       Фактор разбавления                               1
       Предел обнаружения                               0,00005 мг/кг
       Предел количественного определения               0,00015 мг/кг
   
       5.6.2. Ход анализа
       5.6.2.1. Предварительная подготовка
       Перед  использованием набора довести температуру всех реагентов
   до   комнатной   температуры  (20  -  25  -С).   Немедленно   после
   использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры  2  -
   8 -С.
       В  процессе  выполнения  анализа не допускать  высыхания  лунок
   планшета.
       На   всех   стадиях  инкубации  избегать  воздействия   прямого
   солнечного  света. При инкубации планшета закрыть его  непрозрачным
   экраном.
       5.6.2.2. Приготовление раствора конъюгата
       Перед   разбавлением   концентрированного  раствора   конъюгата
   осторожно   встряхнуть   содержимое  флакона.   Для   приготовления
   рабочего   раствора   конъюгата  разбавить   концентрат   конъюгата
   буферным  раствором  1, имеющимся в комплекте набора,  в  отношении
   1:11  (например, смешать 0,2 куб. см концентрата конъюгата с  2  мл
   буфера  -  данного  разведения достаточно  для  4-х  стрипов  по  8
   лунок).
       5.6.2.3. Приготовление раствора антител
       Перед  разбавлением  концентрата антител  осторожно  встряхнуть
   содержимое  флакона.  Для приготовления рабочего  раствора  антител
   разбавить  концентрат буферным раствором 1, имеющимся  в  комплекте
   набора,   в   отношении  1:11  (например,  смешать  0,2   куб.   см
   концентрата  антител  с  2 куб. см буфера 1  -  данного  разведения
   достаточно для 4-х стрипов).
       5.6.2.4.  Приготовление буферного раствора 2 (только  для  проб
   молока)
       Для    приготовления    готового    буферного    раствора    2,
   использующегося при исследовании проб молока, разбавить  концентрат
   буфера 2 в 9 куб. см буферного раствора 1 и энергично перемешать  с
   помощью   встряхивателя  типа  "вортекс",  периодически  подогревая
   раствор  до  40  -С.  Мутность  раствора  не  влияет  на  результат
   определения,  однако  осадок  на дне  флакона  после  перемешивания
   должен равномерно распределяться в объеме раствора.
       5.6.2.5. Подготовка микротитровального планшета
       Перед   выполнением   анализа  из  планшета   следует   извлечь
   необходимое количество стрипов.
       Остальные  стрипы следует тщательно упаковать в  фольгированный
   пакет  вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить  на
   хранение при температуре 2 - 8 -С.
       5.6.2.6. Приготовление стандартных растворов
       Для  приготовления  рабочих стандартных растворов  левомицетина
   концентрированные  растворы,  входящие  в  состав  набора,  следует
   разбавить  буфером  1  (или буфером 2) в указанной  пропорции.  Для
   разбавления использовать только стеклянную посуду.
       После разбавления тщательно перемешивать готовые растворы.
       Для   каждой   серии  исследований  следует   готовить   свежие
   стандартные растворы.
       Стандарт 1:0,05 куб. см концентрата               0 нг/куб. дм
   1 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
       Стандарт 2:0,05 куб. см концентрата              50 нг/куб. дм
   2 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
       Стандарт 3:0,05 куб. см концентрата             150 нг/куб. дм
   3 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
       Стандарт 4:0,05 куб. см концентрата             450 нг/куб. дм
   4 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
       Стандарт 5:0,05 куб. см концентрата            1350 нг/куб. дм
   5 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
       Стандарт 6:0,05 куб. см концентрата            4050 нг/куб. дм
   6 + 0,45 куб. см буферного раствора 1 <*>
   --------------------------------
       <*>  При исследовании образцов молока для разведения стандартов
   использовать буферный раствор 2.
   
       5.6.3. Процедура анализа
       Вставить   в   рамку  планшета  стрипы  (лунки)  в  количестве,
   необходимом для выполнения всех запланированных определений в  двух
   повторностях.   Записать  координаты  лунок,  предназначенных   для
   стандартных  растворов  и  подготовленных  исследуемых   растворов.
   Пример формы записи приведен на рис. 1.
   
   -----T-----T----T-----T----T----T-----T----T-----T----T-----T----¬
   ¦С1  ¦С1   ¦П3  ¦П3   ¦П11 ¦П11 ¦П19  ¦П19 ¦П27  ¦П27 ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦С2  ¦С2   ¦П4  ¦П4   ¦П12 ¦П12 ¦П20  ¦П20 ¦П28  ¦П28 ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦С3  ¦С3   ¦П5  ¦П5   ¦П13 ¦П13 ¦П21  ¦П21 ¦П29  ¦П29 ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦С4  ¦С4   ¦П6  ¦П6   ¦П14 ¦П14 ¦П22  ¦П22 ¦П30  ¦П30 ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦С5  ¦С5   ¦П7  ¦П7   ¦П15 ¦П15 ¦П23  ¦П23 ¦     ¦    ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦С6  ¦С6   ¦П8  ¦П8   ¦П16 ¦П16 ¦П24  ¦П24 ¦     ¦    ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦П1  ¦П1   ¦П9  ¦П9   ¦П17 ¦П17 ¦П25  ¦П25 ¦     ¦    ¦     ¦    ¦
   +----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+----+
   ¦П2  ¦П2   ¦П10 ¦П10  ¦П18 ¦П18 ¦П26  ¦П26 ¦     ¦    ¦     ¦    ¦
   L----+-----+----+-----+----+----+-----+----+-----+----+-----+-----
   
              Рис 1. Пример формы записи координат лунок
         перед выполнением анализа (С - стандарты, П - пробы)
   
       5.6.3.1.  Добавить  по  0,05 куб. см  стандартных  растворов  и
   растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.
       5.6.3.2.  Добавить  по  0,05  куб.  см  разбавленного  раствора
   конъюгата в каждую лунку.
       5.6.3.3.  Добавить  в  каждую лунку по 0,05  куб.  см  готового
   разбавленного   раствора  антител.  Перемешать   вручную,   избегая
   попадания  смеси  в  соседние лунки,  и  оставить  на  инкубацию  в
   течение 2 ч при комнатной температуре (20 - 25 -С).
       5.6.3.4. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку планшета и
   выбить  капли  жидкости,  оставшиеся в  лунках,  путем  энергичного
   троекратного  постукивания  рамки с  лунками  по  столу,  накрытому
   фильтровальной   бумагой.   Наполнить   лунки    0,25    куб.    см
   дистиллированной воды и снова вылить воду. Выбить капли  воды,  как
   описано  выше.  Повторить процедуру промывки лунок  водой  еще  два
   раза.
       5.6.3.5. Добавить по 0,05 куб. см раствора субстрата и по  0,05
   куб.  см  раствора  хромогена в каждую лунку.  Перемешать  вручную,
   соблюдая  осторожность,  и инкубировать при  комнатной  температуре
   (20 - 25 -С) в течение 30 мин. в темноте.
       5.6.3.6. Добавить в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора  стоп-
   реагента  и  хорошо  перемешать вручную. В течение  60  мин.  после
   добавления  стоп-реагента измерить оптическую  плотность  в  каждой
   лунке при 450 нм (нулевое считывание по воздуху).
       5.6.4.  Определение  количества  левомицетина  в  исследованных
   пробах
       Средние  значения оптической плотности, измеренной в лунках  со
   стандартными   и  исследуемыми  растворами,  делятся   на   среднее
   значение  оптической  плотности,  измеренной  в  лунках  с   первым
   (нулевым)  стандартом, результат умножается на 100. Таким  образом,
   результат измерения оптической плотности выражается в процентах  от
   оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
   
           Оптическая плотность лунки
              со стандартной пробой
           -------------------------- х 100 = % поглощения.
           Оптическая плотность лунки
              с нулевым стандартом
   
       По   величинам   относительного  поглощения,  вычисленным   для
   стандартных  растворов,  и соответствующим  значениям  концентрации
   левомицетина    в   нг/кг   строится   калибровочная    кривая    в
   полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая  должна
   быть почти линейна в диапазоне 50 - 1350 нг/кг (см. рис. 2).
   
          Рис. 2. Калибровочная кривая, полученная для набора
                   реагентов "Ридаскрин Левомицетин"
                                   
                        Рисунок не приводится.
   
       Концентрация  левомицетина в растворах исследуемых  образцов  в
   нг/кг   (или  нг/куб.  дм)  определяется  по  калибровочной  кривой
   соответственно    относительному    поглощению,    измеренному    и
   вычисленному для этих растворов.
       Для   того   чтобы   вычислить  концентрацию   левомицетина   в
   исследуемой  исходной  пробе, величину  концентрации  левомицетина,
   полученную   по   калибровочной   кривой,   следует   умножить   на
   соответствующий  фактор  разбавления (см. п.  5.5.1.1  -  5.5.1.4).
   Результат исследования выражают в мг/кг или мг/куб. дм.
       При  выполнении  пробоподготовки по п.  п.  5.5.1.3  и  5.5.1.4
   холостые  пробы могут показывать положительный результат на  уровне
   2-й  стандартной  пробы.  При расчете концентрации  левомицетина  в
   исследуемых  пробах  рекомендуется  учитывать  фоновый   сигнал   с
   помощью  постановки  холостого опыта.  Для  этого  в  каждой  серии
   анализов   необходимо  выполнять  испарение  4  куб.   см   чистого
   этилацетата  и  далее следовать процедуре, описанной  в  п.  5.5.3.
   Измеренный  фоновый  сигнал  далее  следует  вычитать   на   стадии
   обработки результатов.
   
                      5.7. Обработка результатов
   
       5.7.1.  За окончательный результат измерения принимают  среднее
   арифметическое    результатов   двух   параллельных    определений.
   Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.
   
                                                             Таблица 2
   
        МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА
       ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ ЖИВОТНОГО
                  ПРОИСХОЖДЕНИЯ (МОЛОКЕ, МЯСЕ, ЯЙЦАХ)
   
   ---------------------------------T-------------------------------¬
   ¦    Статистический параметр     ¦   Соединение - хлорамфеникол  ¦
   +--------------------------------+-------------------------------+
   ¦Нижний предел определения,      ¦0,00008                        ¦
   ¦мг/кг                           ¦                               ¦
   +--------------------------------+-------------------------------+
   ¦Интервал надежного определения, ¦0,0001 - 10,0                  ¦
   ¦мг/кг                           ¦                               ¦
   +--------------------------------+-------------------------------+
   ¦Среднее значение открываемости  ¦105 (70 - 140)                 ¦
   ¦(показатель правильности), %    ¦                               ¦
   +--------------------------------+-------------------------------+
   ¦Допустимое расхождение между    ¦8,0                            ¦
   ¦результатами двух параллельных  ¦                               ¦
   ¦определений хлорамфеникола,     ¦                               ¦
   ¦полученными в одной лаборатории ¦                               ¦
   ¦в одной серии измерений         ¦                               ¦
   ¦(сходимость), при Р = 0,95% не  ¦                               ¦
   ¦должно превышать, %             ¦                               ¦
   +--------------------------------+-------------------------------+
   ¦Допустимое расхождение между    ¦10,0                           ¦
   ¦результатами двух параллельных  ¦                               ¦
   ¦определений хлорамфеникола,     ¦                               ¦
   ¦выполненных в двух разных ла-   ¦                               ¦
   ¦бораториях (воспроизводимость), ¦                               ¦
   ¦при Р = 0,95% не должно превы-  ¦                               ¦
   ¦шать по отношению к среднему, % ¦                               ¦
   L--------------------------------+--------------------------------
   
       5.7.2.   Если   расхождение   результатов   двух   параллельных
   определений  (сходимость и воспроизводимость) превышает  требования
   по   п.   5.6.1,   то  повторно  проводят  два  новых  параллельных
   определения.
   
   

<<< Назад

 
Реклама

Новости


Реклама

Новости сайта Тюрьма


Hosted by uCoz