Право
Навигация

 

Реклама




 

 

Ресурсы в тему

 

Реклама

Секс все чаще заменяет квартплату

Новости законодательства Беларуси

 

СНГ Бизнес - Деловой Портал. Каталог. Новости

 

Рейтинг@Mail.ru


Законодательство Российской Федерации

Архив (обновление)

 

 

МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2008-05 (УТВ. ГЛАВНЫМ ГОСУДАРСТВЕННЫМ САНИТАРНЫМ ВРАЧОМ РФ 17.10.2005)

(по состоянию на 20 октября 2006 года)

<<< Назад


                                                             Утверждаю
                                              Руководитель Федеральной
                                             службы по надзору в сфере
                                              защиты прав потребителей
                                              и благополучия человека,
                                               Главный государственный
                                                       санитарный врач
                                                  Российской Федерации
                                                          Г.Г.ОНИЩЕНКО
                                                  17 октября 2005 года
   
                                                       Дата введения -
                                                 с момента утверждения
   
                         4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
              БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
                  ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
                                   
         МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
      ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
            ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
                                   
                         МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
                            МУК 4.2.2008-05
   
       1.   Разработаны:  ГУ  НИИ  питания  РАМН  (В.А.   Тутельян   -
   руководитель,  Е.Ю.  Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А.  Кашина);  ФГУЗ
   "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзор  России
   (Т.В.   Воронцова,   Т.Н.   Потапова);   Инновационная   корпорация
   "Биозащита" (И.В. Панкин).
       2.  Рекомендован  к  утверждению Комиссией по  государственному
   санитарно-эпидемиологическому нормированию при  Федеральной  службе
   по   надзору  в  сфере  защиты  прав  потребителей  и  благополучия
   человека.
       3.  Утверждены  и  введены  в действие Главным  государственным
   санитарным  врачом Российской Федерации, Руководителем  Федеральной
   службы  по  надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
   человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.
       4. Введены впервые.
   
                         1. Область применения
   
       1.1.   Настоящие   методические   указания   подготовлены   для
   идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее  -
   ГМО)  растительного происхождения в пищевых продуктах с применением
   ферментного  анализа на биологическом микрочипе и  его  последующей
   обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
       1.2.   Методические  указания  разработаны  в  соответствии   с
   Федеральным   законом  от  30.03.1999  N  52-ФЗ  (в   редакции   от
   09.05.2005  N  45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом  благополучии
   населения", Законом Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1  (в
   редакции  от  21.12.2004  N 171-ФЗ) "О защите  прав  потребителей",
   Постановления  Правительства Российской Федерации от  30.06.2004  N
   322  "Об  утверждении Положения о Федеральной службе по  надзору  в
   сфере   защиты   прав   потребителей  и   благополучия   человека",
   Постановления  Правительства Российской Федерации от  15.09.2005  N
   569  "О  Положении  об  осуществлении  государственного  санитарно-
   эпидемиологического надзора в Российской Федерации",  Постановления
   Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в  редакции
   от  15.09.2005  N  569) "Об утверждении Положения о государственном
   санитарно-эпидемиологическом нормировании".
       1.3.   Методические  указания  предназначены  для   органов   и
   учреждений  Федеральной  службы по  надзору  в  сфере  защиты  прав
   потребителей  и  благополучия  человека,  осуществляющих   контроль
   качества   и  безопасности  продовольственного  сырья   и   пищевых
   продуктов,    а    также    других    испытательных    лабораторий,
   аккредитованных в порядке, установленном Правительством  Российской
   Федерации.
       1.4.   Методические  указания  разработаны  для  одновременного
   определения в одном лабораторном испытании пяти различных  маркеров
   рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью  выявления  ГМО
   растительного  происхождения в пищевых продуктах,  в  том  числе  в
   продовольственном сырье.
   
                          2. Общие положения
   
       Методические указания содержат описание метода определения ГМО
   растительного происхождения в пищевых продуктах с  помощью  набора
   реагентов  для  выявления  и   идентификации   ГМО   растительного
   происхождения с применением ферментного анализа  на  биологическом
   микрочипе. Метод основан на  идентификации  рекомбинантной  ДНК  с
   использованием метода  асимметричной  мультиплексной  полимеразной
   цепной  реакции  (далее  -  амПЦР)  и  последующей   гибридизацией
   продуктов  этой  амПЦР  с  применением  ферментного   анализа   на
   биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает  наличие
   или отсутствие в  анализируемой  пробе  не  менее  пяти  различных
   рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных  (35  S,
   nos и ocs) и двух селективных  (gus,  nptII).  Идентификация  этих
   последовательностей позволяет проводить  предварительную  проверку
   пищевых продуктов  на  наличие  ГМО  растительного  происхождения.
                                        -12
   Чувствительность метода - не менее 10    г (1пг) ДНК.
   
        3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
   
       3.1. Аппаратура и инструменты.
       3.1.1.     Амплификатор    ДНК    типа    "Терцик-мс-2"     под
   микроцентрифужные  пробирки  вместимостью  0,2,  0,5  куб.  см   со
   скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее  1,5  -С/с
   ТУ 9642-001-4648062-98.
       3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических
   микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.
       3.1.3.  Компьютерная программа "Аrrа" для анализа  изображений,
   полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001".
       3.1.4.     Биологический    микрочип    с     иммобилизованными
   олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).
       3.1.5.   Термостат   суховоздушный  типа   ТВ3-25   с   рабочей
   температурой  42 -С, рабочий диапазон от 20 -С до 60  -С,  точность
   поддержания температуры +/- 1 -С ТУ 42-61961.
       3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01  2-
   го  класса  точности с пределом допускаемой абсолютной  погрешности
   однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
       3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф
   вместимостью  0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15  до  120  -С,
   количество  гнезд - не менее 20 каждого типа, точность  поддержания
   температуры - 0,2 -С, разность температур между соседними  ячейками
   - не более 0,5.
       3.1.8.  Камера  морозильная  по ГОСТ  26678-85,  обеспечивающая
   температуру минус 20 -С.
       3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.
       3.1.10. Микроцентрифуга  настольная  типа Эппендорф с частотой
                               -1
   вращения не менее 13000 мин.
       3.1.11. Аппарат  для  встряхивания  типа  "Вортекс",  скорость
                           -1
   вращения 250 - 3000 мин.  .
       3.1.12.  Дистиллятор, обеспечивающий качество  дистиллированной
   воды по ГОСТ 6709-72.
       3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования:  0,5  -
   10,0  куб.  мм  (шаг  - 0,1 куб. мм, точность  +/-  2,5%  -  10,0%,
   воспроизводимость 3% - 7%); 0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб.  мм,
   точность  +/-  2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% -  5%);  20,0  -
   200,0  куб.  мм  (шаг  - 1,0 куб. мм, точность  +/-  1,5%  -  2,0%,
   воспроизводимость 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг -  5  куб.  мм,
   точность +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 -  10000
   куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%).
       3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84
   или других видов.
       Примечание:  Допускается  использование  другой  аппаратуры   и
   инструментов    с   аналогичными   техническими   характеристиками,
   разрешенных для применения в установленном порядке.
   
       3.2. Лабораторная посуда и материалы.
       3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.
       3.2.2.  Воронки  стеклянные  ГОСТ  25336-82.  Колбы  стеклянные
   мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200,  1000
   куб. см, ГОСТ 12738-77.
       3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.
       3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25,
   100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
       3.2.5.  Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф  вместимостью
   0,2; 0,5; 1,5 куб. см.
       3.2.6.  Наконечники  с  фильтром  для  дозаторов  с  переменным
   объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.
       3.3. Реактивы и реагенты.
       3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).
       3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
       3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ  6-09-
   11-1721-83.
       3.3.4.  Альбумин  бычий  сывороточный сухой  (БСА).  Корпорация
   "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.
       3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.
       3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
       3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.
       3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.
       Примечание:   Допускается  использование  других  реактивов   с
   аналогичными  техническими характеристиками;  препараты  импортного
   производства  должны  иметь международный сертификат  качества  ИСО
   9000 или EN 29000.
   
       3.3.9.  Набор  реагентов  для  выявления  и  идентификации  ГМО
   растительного происхождения на биологическом микрочипе  состоит  из
   набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора  для
   ДНК  гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны  на  сто
   реакций.
       3.3.10.  Набор  реагентов для пробоподготовки (бисер  -  30  г,
   лизирующий реагент - 60 куб. см (2 флакона), сорбент -  2  куб.  см
   (2   пробирки),   солевой  буфер  (10-кратный)  -   10   куб.   см,
   экстракционный  раствор  -  10 куб. см) ТУ  2643-003-71321417-2004.
   Порядок  приготовления рабочего раствора солевого буфера  описан  в
   4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
       3.3.11.  Набор  реагентов  для амПЦР ТУ  2643-003-71321417-2004
   (включает  в  себя:  сухие смеси реагентов  (100  пробирок,  каждая
   пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты  и
   хлорид  магния с конечными концентрациями, соответственно,  1  ед.,
   200  мкМ  и  2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему  для
   проведения   одной  стандартной  ПЦР);  растворитель;   минеральное
   масло;  "+"  контроль  амплификации -  1  пробирка,  0,5  куб.  см,
   праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
       -  35S_п 5' CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA
   (39 н.о.);
       - 35S_o* 5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG
   A (40 н.о.);
       праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
       -  gus_  5'  АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG  AAG  AGA  (33
   н.о.);
       - gus_o* 5' TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);
       праймеры   на  терминатор  nos  из  агробактерии  Agrobacterium
   tumefaciens:
       -  nos_п  5'  GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG  АСА  GA  (32
   н.о.);
       -  nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35
   н.о.);
       праймеры   на   маркерный   ген  nptII   из   транспазона   Тn5
   бактериального происхождения:
       - npt_п 5' GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
       - npt_o* 5' АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);
       праймеры   на   промотор  ocs  из  агробактерии   Agrobacterium
   tumefaciens:
       -  ocs_п  5'  AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА  ААА  GA  (32
   н.о.);
       -  ocs_o*  5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC  GTA  GA  (32
   н.о.).
       Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.
       Примечание:  35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п  -  обозначают
   прямые   праймеры;  35S_o*;  gus_o*;  nos_o;  nptII_o*;  ocs_o*   -
   обозначают   обратные   праймеры,   меченные   биотином;   н.о.   -
   нуклеотидные остатки.
   
       3.3.12.  Набор  реагентов  для ДНК гибридизации  и  ферментного
   анализа   ТУ   2643-003-71321417-2004:  20xSSC  -   50   куб.   см;
   диаминобензидин  (ДАБ) - 100 таблеток; коньюгат  пероксидазы  хрена
   со  стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1  мг/куб.  см,  1
   пробирка.
       Примечание: Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со  дня
   изготовления.  Основную  часть реагентов, упакованную  в  картонную
   коробку,  хранят в сухом темном месте при температуре от +2  -С  до
   +8  -С.  В  отдельных  пластиковых пакетах при температуре  -20  -С
   хранят  праймеры,  положительный контроль и конъюгат  стрептавидин-
   пероксидазы.
   
           4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов
   
       4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
       В   мерной   колбе   на   100  куб.  см  растворить   18,62   г
   этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный  вес  372,2)  в  80
   куб.   см   дистиллированной  воды.  Раствором  30%-ной  гидроокиси
   довести  рН  раствора  до  8,0,  дистиллированной  водой  -   объем
   раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой  пробкой
   при комнатной температуре до года.
       4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS.
       Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить
   при комнатной температуре не более 1 года.
       4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера.
       Содержимое  флакона с 10-кратным солевым буфером (10  куб.  см)
   (из  набора  реагентов)  перенести из флакона  в  цилиндр,  довести
   бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным  этиловым
   спиртом  -  до  отметки 300 куб. см и перемешать.  Рабочий  раствор
   солевого  буфера следует хранить в герметично закрытой  посуде  при
   температуре 4 -С.
   
       5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
   
       Отбор    проб    проводят   по   государственным    стандартам,
   устанавливающим  порядок отбора проб для однородных  групп  пищевой
   продукции:  ГОСТ  5904-82, 9163-90, 12292-00,  10852-86,  12430-66,
   13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73,  7631-
   85,  12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73,
   26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90,  15877-
   70,  17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02,  ГОСТ
   Р ИСО 2170-97.
   
                 6. Проведение анализа. Выделение ДНК
   
       6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на  1,5
   куб.  см  внести  300  мг  бисера  и  70  -  80  мг  анализируемого
   материала.  Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА  и  термостатировать
   при  65  -С  в  течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет  30
   минут  для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание
   и  др.)  и  до  60  мин.  для зерна. Через каждые  10  -  15  минут
   гомогенизировать  пробу срезанным наконечником  (для  каждой  пробы
   использовать индивидуальный наконечник).
       6.2.  К  содержимому пробирки добавить 400 куб. мм  лизирующего
   реагента   из   набора  реагентов  и  перемешать  на  вортексе   до
   максимально  однородного состояния. Пробу термостатировать  при  65
   -С 60 - 120 мин.
       6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще  раз
   гомогенизировать,  добавить 500 куб. мм бидистиллированной  воды  и
   перемешать на вортексе.
       6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.).
   Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
       6.5.  Добавить  20 куб. мм сорбента из набора реагентов  (перед
   использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на  вортексе).
   Пробирку  поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10  минут
   (10 - 20 об./мин.).
       6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
       6.7.  Осторожно,  не  задевая осадка,  удалить  супернатант.  К
   осадку   добавить  200  куб.  мм  лизирующего  реагента  из  набора
   реагентов  и  перемешать  на  вортексе  до  однородного  состояния.
   Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
       6.8.  Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего
   раствора   солевого   буфера   из  набора   реагентов,   перемешать
   содержимое  пробирки переворачиванием 5 - 10 раз.  Центрифугировать
   пробу 10 секунд при 5000 g.
       6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
       6.10.  К  осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора  солевого
   буфера,  перемешать на вортексе, центрифугировать пробу  10  секунд
   при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
       6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
       6.12. Подсушить осадок при 65 -С в течение 4 - 5 минут.
       6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора  из
   набора  реагентов.  Отбор раствора из исходного  флакона  проводить
   при  постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок  гранул
   ионообменной смолы.
       6.14.  Суспендировать содержимое пробирки на вортексе  5  -  10
   секунд  до гомогенного состояния, затем термостатировать  10  минут
   при 65 -С.
       6.15.    Еще    раз   суспендировать   пробу    на    вортексе,
   центрифугировать 1 мин. при 5000 g.
       6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую
   пробирку  и  хранить  при  -20 -С до проведения  ПЦР  анализа.  При
   отборе   раствора   ДНК   необходимо   избегать   захвата   осадка,
   содержащего сорбент.
       Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения
   ДНК,   возможно  использование  метода  выделения  с  помощью  СТАВ
   (гексадецилтриметиламмониум  бромид),  описанного  в   методических
   указаниях по определению генетически модифицированных источников  в
   продуктах  питания растительного происхождения методом полимеразной
   цепной    реакции   (МУК   4.2.1902-04   "Определение   генетически
   модифицированных   источников  (ГМИ)  растительного   происхождения
   методом полимеразной цепной реакции").
   
                            7. Амплификация
   
       7.1.   Перед   проведением  реакции  вынуть   из   холодильника
   необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из  набора
   реагентов.  Промаркировать соответствующим образом: "-"  контроль",
   "исследуемые пробы", "+" контроль".
       7.2. Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.
       7.3. Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.
       7.4.   В  пробирку,  которая  служит  отрицательным  контролем,
   добавить  5  куб.  мм бидистиллированной воды. В  опытные  пробирки
   добавить  по  5 куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным
   контролем добавить 5 куб. мм раствора контрольной ДНК.
       7.5.  Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла
   (масло   не   используется  в  случае,  если   амплификатор   имеет
   термостатируемую крышку).
       7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в
   термоблок   программируемого  термостата  и   запустить   программу
   амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.
   
                                                             Таблица 1
   
                      ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР
   
   ------------------T---------------T---------------T--------------¬
   ¦  Шаг программы  ¦Температура -С ¦     Время     ¦  Количество  ¦
   ¦                 ¦               ¦инкубации, сек.¦    циклов    ¦
   +-----------------+---------------+---------------+--------------+
   ¦1.               ¦94             ¦180            ¦1             ¦
   +-----------------+---------------+---------------+--------------+
   ¦2.               ¦94             ¦30             ¦42            ¦
   +-----------------+---------------+---------------+              ¦
   ¦3.               ¦62,5           ¦30             ¦              ¦
   +-----------------+---------------+---------------+--------------+
   ¦4.               ¦72             ¦180            ¦1             ¦
   L-----------------+---------------+---------------+---------------
   
       Примечание:   Для   пипетирования   жидкостей   без    примесей
   рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо  иметь
   отдельный    комплект   микродозаторов,   не    используемых    при
   пробоподготовке  или  работах  с ДНК-содержащими  препаратами.  При
   подготовке  смесей  для проведения амПЦР каждую пробирку  открывают
   только   перед   отбором  или  внесением  проб,  а   по   окончании
   манипуляции  сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно
   несколько  микропробирок  с  пробами и оставлять  их  открытыми  на
   длительное время.
   
       7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать
   в  помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы
   для  гибридизации  проводится из-под  слоя  минерального  масла,  в
   случае его использования.
       7.8.  Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением
   ферментного  анализа на биологическом микрочипе в  одном  помещении
   не  допускается.  Реакционные смеси после амплификации  содержат  в
   высоких   концентрациях   фрагменты  ДНК,   контаминация   которыми
   помещений,  оборудования  и реактивов может  привести  к  получению
   ложноположительных результатов.
   
                    8. Проведение ДНК гибридизации
   
       8.1.  Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl,
   0,3  М  цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC;  0,lxSSC,
   0,1%  SDS;  0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора  можно
   воспользоваться таблицей 2.
   
                                                             Таблица 2
   
                  ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC
   
   --------------------T-------------T----------------T-------------¬
   ¦      Раствор      ¦    20хSSC   ¦  10%-ный SDS   ¦  Н О дист.  ¦
   ¦                   ¦             ¦                ¦   2         ¦
   +-------------------+-------------+----------------+-------------+
   ¦2xSSC, 0,1% SDS    ¦10 куб. см   ¦1 куб. см       ¦89 куб. см   ¦
   +-------------------+-------------+----------------+-------------+
   ¦0,1хSSC            ¦0,5 куб. см  ¦-               ¦99,5 куб. см ¦
   +-------------------+-------------+----------------+-------------+
   ¦0,1xSSC, 0,1% SDS  ¦0,5 куб. см  ¦1 куб. см       ¦98,5 куб. см ¦
   +-------------------+-------------+----------------+-------------+
   ¦0,01хSSC           ¦0,05 куб. см ¦-               ¦99,95 куб. см¦
   L-------------------+-------------+----------------+--------------
   
       8.2.    Микропробирки    с    продуктами    амплификации    ДНК
   центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на  дне  пробирки  и
   держать  далее только в вертикальном положении. Добавить  в  каждую
   микропробирку 5 куб. мм 20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать  и
   центрифугировать  1 - 2 секунды. Распределить полученную  смесь  по
   поверхности    микрочипа,    содержащей    зоны    иммобилизованных
   олигонуклеотидов.
       8.3.  Поместить микрочип во влажную камеру (например,  в  чашку
   Петри  со  смоченным  дистиллированной водой бумажным  фильтром)  и
   поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 -С.
       8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и
   затем тщательно промыть чип следующими растворами:
       - 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут;
       - 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;
       - 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте;
       - 0,01хSSC в течение 10 секунд.
   
                   9. Проведение ферментного анализа
   
       9.1.  Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить  в
   200  раз  буфером  1хSSC,  содержащим 1%  BSA  (бычий  сывороточный
   альбумин),  из расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо
   проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5  =  125
   куб.  мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб.
   мм  раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм  1хSSC,
   а затем добавляют 0,75 куб. мм исходного конъюгата.
       9.2.  Нанести 25 - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую
   зону  микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную  камеру  при
   комнатной температуре.
       9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
       9.4. Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.
       9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
       9.6.  Непосредственно  перед  применением  приготовить  раствор
   субстрата  - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить  таблетку
   ДАБ  в  1  куб.  см  буфера 0,1хSSC, добавить 30  куб.  мм  3%-ного
   раствора  пероксида  водорода  и перемешать.  Раствор  использовать
   немедленно.
       9.7.  Залить  рабочую  зону  микрочипа  раствором  субстрата  и
   выдержать  от  2  до 10 минут при комнатной температуре.  В  случае
   положительной  реакции  появляются  коричневые  пятна   окисленного
   субстрата.
       9.8.  Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли
   воды  и  поместить в термостат 42 -С на 5 - 10 минут.  После  сушки
   микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
   
               10. Сканирование биологических микрочипов
   
       10.1.   В   соответствии   с  руководством   по   эксплуатации,
   поставляемым   в   комплекте  с  аппаратно-программным   комплексом
   "ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе.
       10.2.    Поместить   микрочип   в   рамку   для   сканирования,
   зафиксировать его и закрыть рамку.
       10.3.  Запустить  программу  сканирования,  функционирующую   в
   диалоговом  режиме, дождаться появления на мониторе  приглашения  к
   сканированию  и  только после этого вставить рамку с  микрочипом  в
   приемное окно детектора.
       10.4.   После  завершения  сканирования  микрочипа   необходимо
   сохранить   изображение   (Приложение   1   Б),   присвоив    файлу
   соответствующее имя.
       10.5.  Для завершения работы с программой сканирования  следует
   нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
   
                    11. Анализ изображений биочипов
   
       11.1.   Запустить  программу  обработки  изображения  микрочипа
   "Аrrа".
       11.2.  Ввести оцифрованное изображение в программу,  для  этого
   нужно  выбрать  опцию меню "Файл", и затем открыть  изображение.  В
   появившемся  диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены
   изображения,   и   выбрать  в  списке  нужный  файл,   после   чего
   изображение появится в основном окне программы.
       11.3.  Провести  операцию  разметки матрицы,  чтобы  совместить
   центры   измерительных   зондов  с   центрами   пятен   решетки   в
   изображении,  для  этого  выбрать опцию меню  "Анализ"  и  затем  -
   "Разметка     матрицы".    Разметка    начинается    с    рисования
   прямоугольника,  боковые  стороны которого  проходят  через  центры
   узлов  крайних  столбцов. Для этого нужно  щелкнуть  левой  кнопкой
   мыши  в  центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем,  держа  кнопку
   нажатой,    переместить   правую   нижнюю   вершину    появившегося
   прямоугольника в центр нижнего правого узла.
       11.4.  В результате предварительной разметки на экране появится
   четырехугольник  с внутренними линиями, расположенными  равномерно,
   в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
       11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно
   нажать клавишу "Принять".
       11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую
   коррекцию  положения  зондов. Для этого  в  меню  выбирается  опция
   "Настройки/Автоматическая подстройка".
       11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ"
   - "Показать результаты".
       11.8.    По   окончании   измерений   программа   предоставляет
   возможность    подготовки   и   распечатки   протокола    испытаний
   (Приложение 2). Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл"  и  затем
   -  "Заполнить  протокол". После этого появится окно  с  формой  для
   заполнения.  После  того  как она будет  заполнена,  нажать  кнопку
   "Выход".
   
                     12. Интерпретация результатов
   
       12.1.  Появление  регистрируемого компьютерной программой  Аrrа
   оптического  сигнала в одной, нескольких или  во  всех  пяти  зонах
   гибридизации,    содержащих    иммобилизованные    олигонуклеотиды,
   указывает  на  присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей  о
   наличии  ГМО  растительного происхождения в  анализируемом  образце
   (пробе).
       12.2.  Отсутствие регистрируемого оптического сигнала  во  всех
   пяти    гибридизационных    зонах,   содержащих    иммобилизованные
   олигонуклеотиды,  указывает  на не содержание  рекомбинантной  ДНК,
   что  свидетельствует о том, что анализируемый  образец  (проба)  не
   имеет ГМО растительного происхождения.
       12.3.  Появление  оптического сигнала в зоне  гибридизации  при
   использовании       отрицательного      контроля      амплификации,
   свидетельствует   о   получении   ложноположительного   результата.
   Причиной  может  быть загрязнение реактивов и/или  оборудования.  В
   этом  случае необходимо обработать поверхности лабораторных  столов
   и  оборудования раствором 1 H соляной кислоты, заменить реактивы на
   свежеприготовленные и повторить анализ.
       12.4.   Отсутствие   оптического  сигнала   при   использовании
   положительного  контроля амплификации свидетельствует  о  получении
   ложноотрицательного   результата.  Причиной   могут   быть   потеря
   активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР  и/или
   гибридизации  с  применением ферментного анализа  на  биологическом
   микрочипе.   В   этом  случае  необходимо  заменить   реактивы   на
   свежеприготовленные и повторить анализ.
   
                     13. Организация рабочих мест
   
       Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных
   в  настоящих  методических указаниях, проводится в  соответствии  с
   МУК    4.2.1902-04    "Определение   генетически   модифицированных
   источников  (ГМИ) растительного происхождения методом  полимеразной
   цепной реакции".
   
   
   
   
   
                                                          Приложение 1
   
            ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР
                      НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
   
       А
   
   --------------------------------------------------T--------------¬
   ¦     35S      gus      nos     nрtII     ocs     ¦     М.П.     ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   ¦    -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   ¦              ¦
   ¦    ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦              ¦
   ¦    L-----   L-----   L-----   L-----   L-----   ¦              ¦
   ¦    -----¬   -----¬                              ¦              ¦
   ¦    ¦K(-)¦   ¦K(-)¦                              ¦              ¦
   ¦    L-----   L-----                              ¦              ¦
   ¦    -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   ¦              ¦
   ¦    ¦K(+)¦   ¦K(+)¦   ¦K(+)¦   ¦K(+)¦   ¦K(+)¦   ¦              ¦
   ¦    L-----   L-----   L-----   L-----   L-----   ¦              ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   L-------------------------------------------------+---------------
   
       Б
   
   --------------------------------------------------T--------------¬
   ¦     35S      gus      nos     nрtII     ocs     ¦     М.П.     ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   ¦    -----¬            -----¬                     ¦              ¦
   ¦ ОП ¦    ¦            ¦    ¦                     ¦              ¦
   ¦    L-----            L-----                     ¦              ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   ¦ К-                                              ¦              ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   ¦    -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   -----¬   ¦              ¦
   ¦ К+ ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦    ¦   ¦              ¦
   ¦    L-----   L-----   L-----   L-----   L-----   ¦              ¦
   ¦                                                 ¦              ¦
   L-------------------------------------------------+---------------
   
       А - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации
   ГМИ растительного происхождения;
       Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в
   результате  анализа  генетически модифицированной  сои,  содержащей
   промотор 35S и терминатор nos.
   
   
   
   
   
                                                          Приложение 2
   
              ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ
           ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)
         РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО
                  АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
   
                           ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
                           Серия АБ N 0000000
                 N _________ от "__" __________ 200_ г.
   
       Продукция ____________________________________________________
       Производитель сырья или продукции ____________________________
       Предъявитель сырья или продукции _____________________________
       Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом
       на соответствующую группу сырья или продукции ________________
       Акт отбора проб и техническое задание на испытания N __ от ___
       Испытания проведены на основании требований
       Номер образца ________________________________________________
       Характеристика   испытуемого    образца    (маркировка,  вид и
       состояние  упаковки,  этикетки,   штрих-кода)
       в образцах N ____ отсутствует, а в образце N ____ присутствует
       Маркировка: __________________________________________________
       Годен до ________________ Штриховой код ______________________
   
       Результаты испытаний
   
   ----------T------------------------------------------------------¬
   ¦  Номер  ¦           Трансгенные последовательности             ¦
   ¦ образца +------------T-----------T------------T--------T-------+
   ¦         ¦     35S    ¦    gus    ¦    nos     ¦ nptII  ¦  ocs  ¦
   +---------+------------+-----------+------------+--------+-------+
   ¦         ¦            ¦           ¦            ¦        ¦       ¦
   L---------+------------+-----------+------------+--------+--------
   
       Результаты анализа ___________________________________________
       ______________________________________________________________
       ______________________________________________________________
       ______________________________________________________________
   Исполнители:
       _____________________                  _____________________
             (подпись)                              (подпись)
       _____________________                  _____________________
             (подпись)                              (подпись)
   
       Руководитель испытательной лаборатории _______________________
                                                     (подпись)
   
               М.П.                           _______________________
                                                (Фамилия, инициалы)
   
       Заключение  распространяется  на  образец,  представленный   на
   испытания.
   
   
   
   
   
                          НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
   
       1.  Федеральный  закон  от 30.03.1999 N 52-ФЗ  (в  редакции  от
   09.05.2005  N  45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом  благополучии
   населения".
       2.  Закон  Российской  Федерации  от  07.02.1992  N  2300-1  (в
   редакции от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей".
       3.   Постановление   Правительства  Российской   Федерации   от
   24.07.2000  N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об  утверждении
   Положения     о     государственном    санитарно-эпидемиологическом
   нормировании".
       4.   Постановление   Правительства  Российской   Федерации   от
   15.09.2005  N  569  "О Положении об осуществлении  государственного
   санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
       5.   Постановление   Правительства  Российской   Федерации   от
   30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе  по
   надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".
       6.  Постановление  Главного государственного санитарного  врача
   Российской  Федерации  от  08.11.2000 N 14  "О  порядке  проведения
   санитарно-эпидемиологической    экспертизы    пищевой    продукции,
   полученной из генетически модифицированных источников".
       7.  Постановление  Главного государственного санитарного  врача
   Российской  Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об  усилении  надзора  за
   пищевыми продуктами, полученными из ГМИ".
       8.  СанПиН  2.3.2.1078-01 "Продовольственное  сырье  и  пищевые
   продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой  ценности
   пищевых продуктов".
       9. ГОСТ 5904-82с "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы
   отбора и подготовки проб".
       10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски".
   Технические условия".
       11. ГОСТ 12292-2000 "Консервы рыбные с растительными гарнирами.
   Технические условия".
       12.  ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и  методы
   отбора проб".
       13.   ГОСТ  12430-66  "Продукция  сельскохозяйственная.  Методы
   отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе".
       14.  ГОСТ  26313-84  "Продукты  переработки  плодов  и  овощей.
   Правила приемки, методы отбора проб".
       15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки  и
   методы отбора проб".
       16.  ГОСТ  27668-88  "Мука и отруби. Приемка  и  методы  отбора
   проб".
       17.  ГОСТ  26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и  методы  отбора
   проб".
       18.  ГОСТ  9792-73  "Колбасные изделия и продукты  из  свинины,
   баранины,  говядины и мяса других видов убойных  животных  и  птиц.
   Правила приемки и методы отбора проб".
       19.   ГОСТ   7631-85  "Рыба,  морские  млекопитающие,   морские
   беспозвоночные   и   продукты  их  переработки.  Правила   приемки,
   органолептические методы оценки качества, методы  отбора  проб  для
   лабораторных испытаний".
       20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила
   приемки и методы отбора проб".
       21.  ГОСТ  Р  51447-99 "Мясо и мясные продукты.  Методы  отбора
   проб".
       22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
       23.  ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными
   добавками. Технические условия".
       24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки,
   методы отбора и подготовка проб к анализу".
       25.  ГОСТ  27668-88  "Мука и отруби. Приемка  и  методы  отбора
   проб".
       26.  ГОСТ  27853-88 "Овощи соленые и квашеные,  плоды  и  ягоды
   моченые. Приемка, отбор проб".
       27.  ГОСТ  28741-90  "Продукты питания из  картофеля.  Приемка,
   подготовка проб и методы испытаний".
       28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
       29.  ГОСТ  13634-90  "Кукуруза.  Требования  при  заготовках  и
   поставках".
       30.   ГОСТ   15877-70   "Кукуруза  сахарная   консервированная.
   Технические условия".
       31.  ГОСТ  17110-71 "Соя (промышленное сырье).  Требования  при
   поставках. Технические условия".
       32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
       33. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
       34. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
       35.  ГОСТ  Р  51926-2002 "Консервы. Икра  овощная.  Технические
   условия".
       36.  ГОСТ  ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб  молотых
   продуктов".
   
   

<<< Назад

 
Реклама

Новости


Реклама

Новости сайта Тюрьма


Hosted by uCoz