Утверждаю
Руководитель Департамента
ветеринарии Минсельхоза России
Е.А.НЕПОКЛОНОВ
29 сентября 2003 г. N 13-5-02/0855
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОМУ КОНТРОЛЮ КАЧЕСТВА
ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
Настоящие Методические указания предназначены для лабораторных
работников отделов микробиологического контроля (ОБК) организаций
по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных
(племпредприятий).
В соответствии со ст. 33 Федерального закона от 03.08.1995 N
123-ФЗ "О племенном животноводстве" организация по искусственному
осеменению сельскохозяйственных животных содержит племенных быков-
производителей, которые используются для получения спермы.
Указанная организация проводит работы по получению, обработке,
контролю качества, хранению и поставке семени (спермы) для
проведения искусственного осеменения сельскохозяйственных животных
и создается по согласованию с Минсельхозом России.
В соответствии со ст. 23 Федерального закона от 03.08.1995 N
123-Ф3 "О племенном животноводстве" семя (сперма) племенных
животных может быть реализована другим лицам исключительно
организациями по искусственному осеменению сельскохозяйственных
животных (племпредприятиями).
Методические указания разработаны на основании Закона
Российской Федерации от 14.05.1993 N 4979-1 "О ветеринарии",
Федерального закона от 03.08.1995 N 123-Ф3 "О племенном
животноводстве", Требований Международного ветеринарного кодекса
(млекопитающие, птицы и пчелы) Международного эпизоотического
бюро, уставных требований организаций по искусственному осеменению
сельскохозяйственных животных в целях ветеринарно-санитарного
контроля качества замороженной спермы быков-производителей.
Настоящие Методические указания содержат: описание порядка
отбора проб спермы быков-производителей, методы микробиологических
исследований на наличие условно-патогенных микроорганизмов и
грибов. Приведены рецепты питательных сред, рекомендованные для
микробиологического исследования замороженной спермы быка-
производителя.
Быки-доноры, от которых отбирают сперму, должны быть клинически
здоровы и иметь отрицательные результаты лабораторных
исследований, проведенных согласно действующим ветеринарно-
санитарным правилам, на следующие инфекционные болезни: бруцеллез,
туберкулез, паратуберкулезный энтерит, лептоспироз, инфекционный
ринотрахеит, хламидиозный аборт, лейкоз, трихомоноз,
кампилобактериоз, вирусная диарея.
Технологию получения и криоконсервации спермы должны проводить
в соответствии с требованиями действующей Инструкции по технологии
работы организаций по искусственному осеменению и трансплантации
эмбрионов сельскохозяйственных животных, утвержденной Приказом
Минсельхоза России от 9 июня 2003 г. N 819.
Санитарный контроль качества спермы проводят по следующим
показателям:
- определение общего количества микроорганизмов - микробное
число в 1 дозе спермы;
- определение коли - титра в 1 куб. см спермы;
- наличие грибов.
1. Порядок отбора проб спермы быков-производителей
для оценки по санитарному качеству
Оценку санитарного качества каждой серии замороженной спермы
быков-производителей проводит врач-микробиолог (контролер) отдела
микробиологического контроля (ОБК) организации по искусственному
осеменению сельскохозяйственных животных. При закладке в
карантинное хранилище из каждой серии спермы для исследования
отбирают 4 - 8 доз в зависимости от расфасовки.
1.1. Взятие проб замороженной спермы для ветеринарно-санитарной
оценки ее качества необходимо проводить с соблюдением правил
асептики с целью исключения контаминации спермы микрофлорой из
окружающей среды.
1.2. Замороженная сперма быков должна быть отобрана для
исследования посерийно.
1.3. Серией замороженной спермы считают любое количество доз,
полученных от одного производителя из одного или нескольких
смешанных эякулятов, заготовленных за один технологический цикл,
оформленных одной датой, одним номером и документом о качестве.
1.4. Пробы отбирают стерильными пинцетами в сухие стерильные
пробирки или флаконы из-под антибиотиков и герметически закрывают
стерильными пробками.
1.5. Пробу замороженной спермы, предназначенную для
исследования, маркируют с указанием номеров серии, клички,
инвентарного номера быка и даты замораживания спермы.
1.6. В замороженной сперме не допускается наличие патогенных
микроорганизмов, грибов, микоплазм. Содержание непатогенных
микроорганизмов (не вызывающих гемолиза, плазмокоагуляции, гибели
мышей и не проявляющих рост в присутствии санирующих веществ в
терапевтических дозах) допускается до 500 м.т. в дозе. Коли-титр
должен быть выше 0,1 куб. см, т.е. отрицательный.
1.7. При наличии в хранилище замороженной спермы от быков-
производителей, не проверенных на инфекционные болезни в
соответствии с ветеринарно-санитарными требованиями, сперма
бракуется и подлежит утилизации путем автоклавирования при 2 атм.
в течение 2-х часов.
1.8. При отсутствии ОБК в организации по искусственному
осеменению сельскохозяйственных животных оценку санитарного
качества замороженной спермы проводят в ветлаборатории (районной,
зональной, областной, республиканской).
Из карантинного хранилища формируют среднюю пробу замороженной
спермы, полученной от 1 быка в течение месяца. От каждой серии
отбирают 1 - 2 дозы в зависимости от расфасовки спермы. Отбор проб
спермы проводят в присутствии представителя ветлаборатории,
осуществляющей исследование, не реже 1 раза в месяц. При получении
неудовлетворительных результатов исследования проверяется каждая
серия спермы.
1.9. Отобранные пробы спермы помещают в сосуды Дьюара,
предварительно продезинфицированные, наполненные жидким азотом не
менее 2/3 емкости и обеспечивающие ее хранение в замороженном
состоянии на все время транспортировки и хранения до начала
исследования.
1.10. К направляемым для исследования пробам спермы прилагается
сопроводительный документ, в котором должно быть указано:
наименование предприятия-изготовителя, его товарный знак,
наименование продукции, данные о благополучии предприятия по
инфекционным болезням и результаты последнего обследования быков-
производителей, форма упаковки спермодоз, номера серий, дата
замораживания спермы и количество спермодоз в серии, подпись
руководителя предприятия и лица, проводившего отбор проб спермы.
1.11. Всю сперму, завезенную по импорту, выдерживают в
карантинном хранилище не менее 30 дней. В этот период проводят
исследования согласно настоящих Методических указаний и
ветеринарных требований.
1.12. На замороженную сперму, реализуемую в пределах области, в
которой находится организация по искусственному осеменению
сельскохозяйственных животных, ведомственным контролером ОБК
племпредприятия, аттестованным Федеральным государственным
учреждением Всероссийским государственным научно-исследовательским
институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных
препаратов - центром качества ветеринарных препаратов и кормов
(ФГУ ВГНКИ), выдается технологический паспорт (сертификат)
(Приложение 2). При вывозе спермы за пределы субъекта РФ, кроме
технологического паспорта, государственной ветеринарной службой
области, края, республики выдается ветеринарное свидетельство
(сертификат) о благополучии быков-производителей по инфекционным
болезням (на основании результатов обследования) по утвержденной
форме.
2. Методы микробиологических исследований
замороженной спермы
2.1. Подготовка к исследованиям
2.1.1. Флаконы или пробирки с замороженной спермой вынимают из
жидкого азота и оставляют при комнатной температуре до полного
оттаивания проб.
2.1.2. Пайетты, ампулы, облицованные гранулы со спермой перед
вскрытием обрабатывают ватным тампоном, смоченным спиртом-
ректификатом. Стерильным пинцетом придерживают один конец пайетты,
ампулы или облицованной гранулы, а другой конец срезают
стерильными ножницами. Размороженную сперму выливают в стерильную
сухую пробирку.
2.1.3. Разведения для посевов спермы готовят следующим образом:
к 0,9 куб. см стерильного 0,9%-ного раствора хлористого натрия
добавляют 1 куб. см оттаянной спермы. Тщательно перемешивают и
готовят десятикратные разведения, в зависимости от степени
ожидаемой контаминации спермы, начиная с разведения 1:10.
Для каждого разведения спермы используют одну стерильную
пипетку. Раствор набирают с помощью резиновой груши или
полиэтиленового баллончика и тщательно (не менее трех раз)
промывают пипетку раствором из той пробирки, в которую внесли
суспензию.
2.2. Определение общего числа (микробного числа)
микроорганизмов в 1 мл спермы
2.2.1. Сперму, подготовленную по п. 2.1.3, высевают на одну из
следующих трех питательных сред: 2% мясопептонный агар с 1%
глюкозы и 5% крови барана или крупного рогатого скота; агар
Хоттингера или тиогликолевую среду (рецепты в Приложении 1).
2.2.2. Разбавленную сперму переносят из среды (высевают)
стерильной градуированной пипеткой в количестве 1,0 куб. см в
чашки Петри (из расчета не менее трех чашек на каждое разведение)
и равномерно распределяют материал по всей поверхности агара
покачиванием чашек. Чашки с посевами помещают в термостат при
температуре 37 +/- 0,5 -С и инкубируют в течение 48 часов. Подсчет
колоний, выросших на поверхности агара, и определение числа
микробных тел в 1 дозе (микробное число) проводят по ГОСТу 20909.2-
75.
2.3. Определение коли-титра
2.3.1. Разбавленную по п. 2.1.3 сперму в количестве 1 куб. см
вносят в пробирку со средой Булира. Посевы выдерживают в
термостате при температуре 44 - 45 -С в течение 24 часов. В
результате осмотра пробирок устанавливают бродильный титр.
2.3.2. К группе кишечной палочки относят все разновидности
кишечной палочки, способные ферментировать жидкую среду,
содержащую глюкозу и маннит, с выделением кислоты и газа в течение
24 часов инкубации при температуре 44 - 45 -С.
2.3.3. При отсутствии помутнения среды газообразования реакцию
считают отрицательной. Изменение цвета среды (пожелтение,
помутнение) и газообразование (пузырек в газовке) указывают на
наличие в среде микробов из группы кишечной палочки. В этом случае
реакцию считают положительной.
2.3.4. При наличии положительной реакции на бродильный титр
проводят исследование на идентификацию кишечной палочки по ГОСТу
20909.2-75.
2.3.5. Коли-титром считают наименьший объем исследуемого
материала, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Коли-титр
выражают степенью разведения: 1:10 - 0,1; 1:100 - 0,01 и т.д.
2.4. Исследование на наличие синегнойной палочки, анаэробной
микрофлоры, грибов
2.4.1. Для выделения синегнойной палочки исследуемый материал
высевают на мясопептонный бульон с добавлением 1 - 2% сахара
(глюкозы, лактозы) и инкубируют посевы в течение 6 - 7 суток в
термостате при температуре 37 +/- 0,5 -С, проверяя рост каждые 1 -
2 дня. При росте микроб продуцирует водорастворимый пигмент
пиоцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-
голубой цвет. На мясопептонном агаре он дает круглые голубовато-
серые колонии. При микроскопии - грамотрицательная палочка.
Основной признак культуры синегнойной палочки - положительная
хлороформная проба: к 18-часовой культуре добавляют 1,0 мл
хлороформа. Культура, давшая положительную реакцию (окраска
хлороформа в синий цвет), относится к синегнойной палочке.
2.4.2. Для выделения анаэробных бактерий, помимо
соответствующей среды и температурного оптимума, требуется
создание бескислородных условий. Лучше всего для выращивания
анаэробов применять среду Китт-Тароцци. Исследуемый материал
засевают по 1 - 2 капли в 2 пробирки с указанной средой. Одну из
пробирок после посева материала подогревают в водяной бане при
температуре 80 -С в течение 20 минут для уничтожения сопутствующей
вегетативной микрофлоры. Затем засеянные пробирки помещают в
термостат при 37 -С на 10 суток. На печеночном бульоне учитывают
интенсивность роста, характер осадка, а также наличие и степень
газообразования. Дальнейшую идентификацию проводят по методикам
исследования анаэробных микроорганизмов.
2.4.3. Для исследования на наличие грибов чашки с высевами
спермы на мясопептонном агаре после подсчета количества микробных
тел оставляют при комнатной температуре на 8 - 10 суток в месте,
удаленном от прямых солнечных лучей. По истечении этого срока
чашки с посевами проверяют на наличие в них роста грибов.
Идентифицирование выросших грибов проводят по Методике
микологического исследования и оценки спермы, применяемой при
искусственном осеменении с/х животных, утвержденной ГУВ МСХ СССР
02.01.1978.
2.5. Идентификация выделенных микроорганизмов
2.5.1. Чашки с первичными посевами после учета числа выросших в
них микроорганизмов используют для выделения чистых культур
(изолятов) с последующей их идентификацией.
2.5.2. Изучают визуально морфологию колоний микроорганизмов,
выросших на чашках с питательными средами: размер, форму,
поверхность, цвет.
2.5.3. Из колоний, выросших на питательной среде, готовят
мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют и делят
микроорганизмы в зависимости от окраски на грамположительные и
грамотрицательные.
2.5.4. Для выделения чистой культуры изолированную колонию
одного вида или ее часть бактериологической петлей над пламенем
горелки переносят в пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и на
поверхность скошенного мясопептонного агара (МПА) штрихом. Посевы
инкубируют при температуре 37,5 +/- 0,5 -С 24 - 48 часов.
2.5.5. Выделение чистой культуры необходимо для изучения
культуральных и ферментативных признаков, по совокупности которых
определяется видовая принадлежность исследуемого микроба.
2.5.6. Изучение морфологических и культуральных свойств
микробов. В посевах на МПА отмечают наличие пигмента и другие
морфологические особенности. В посевах на МПБ отмечают рост
бактерий с равномерным помутнением среды, придонный рост с
образованием осадка на дне (скудным или обильным, крошковидным или
хлопьевидным), образование пигмента, наличие на поверхности
бульона пленки или пристеночного кольца.
2.5.7. При изучении ферментативных свойств определяют наличие
протеолитических ферментов, сахаролитических и других свойств. Для
этого исследуемую культуру высевают на специальные дифференциально-
диагностические среды.
2.6. Определение патогенности выделенных микроорганизмов
2.6.1. Патогенность микробов определяют по гемолитическим,
плазмокоагулирующим свойствам и биопробе - способности убивать
белых мышей.
2.6.2. Гемолитические свойства - способность гемолизировать
эритроциты крови - определяют на чашках Петри с кровяным агаром.
Для этого изолированную культуру микроба высевают на поверхность
МПА, содержащего 5% крови. Посевы инкубируют при температуре 37 +/-
0,5 -С в течение 48 часов. При наличии вокруг выросших колоний зон
гемолиза альфа- или бета-реакцию считают положительной.
2.6.3. Плазмокоагуляция - способность патогенных микробов
(преимущественно стафилококков) свертывать цитратную плазму крови
кролика. Реакцию плазмокоагуляции проводят с использованием сухой
стандартной плазмы кролика, в соответствии с общепринятой
методикой исследований.
Для постановки реакции берут 0,5 куб. см плазмы, разведенной
1:5, которую переносят в стерильную пробирку и добавляют 18 - 20-
часовую культуру изолята (культуру берут бактериологической
петлей). Пробирки помещают в термостат при 37,5 +/- 0,5 -С и
проверяют наличие свертывания плазмы через 1, 2, 5, 18 и 24 часа.
Патогенные микробы продуцируют фермент плазмокоагулазу, который
свертывает плазму. Реакция считается положительной независимо от
времени свертывания плазмы и вязкости сгустка.
Настоящие Методические указания разработаны Департаментом
ветеринарии и Департаментом животноводства и племенного дела
Минсельхоза России, Федеральным государственным учреждением
Всероссийским государственным научно-исследовательским институтом
контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов -
центром качества ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ).
Приложение 1
РЕЦЕПТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД,
РЕКОМЕНДОВАННЫЕ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ БЫКА
2% МПА с 1% глюкозы и 5% крови барана:
мясопептонного бульона 1,0 мл
агара 20,0 мл
глюкозы 10,0 г
цитрированной крови барана 50,0 мл
рН среды 7,0 - 7,2
Тиогликолевая среда:
дистиллированной воды 1,0 л
панкреатического гидролизата казеина 15,0 г
экстракта дрожжей 5,0 г
хлорида натрия 2,5 г
глюкозы 5,0 г
тиогликолевой кислоты или тиогликолята натрия 0,3 мл
рН среды 7,0 - 7,2
Среда Хоттингера:
водопроводной воды 800,0 мл
перевара Хоттингера 200,0 мл
хлористого натрия 0,4 г
агара 2,5 г
рН среды 7,6 - 7,8
Среда Булира:
мясопептонного бульона 100,0 мл
маннита 250,0 мг
глюкозы 10,0 г
Насыщенный водный раствор нейтральрота До окрашивания смеси в
в вишнево-красный цвет
рН среды 7,0 - 7,4
Среда Китт-Тароцци:
Печень крупного рогатого скота или мясо нарезают мелкими
кусочками, заливают троекратным количеством питательного бульона
(рН среды 7,4 - 7,6) и кипятят 30 мин. Мясопептонный бульон
фильтруют, а печень (мясо) промывают на сите водопроводной водой.
Распределяют по пробиркам по 3 - 4 г печени или мяса и по 7 - 8 мл
бульона. Стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 мин.
Приложение 2
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ
(СЕРТИФИКАТ) НА СПЕРМУ БЫКА
1. Название и адрес организации - владельца быка-производителя
_____________________________________________________________
2. Сведения о быке-производителе:
Кличка _______________________________________________________
инд. N _______________________________________________________
порода _______________________________________________________
3. Данные о сперме:
Кол-во доз замороженной спермы _______________________________
дата отправки ________________________________________________
способ замораживания (гранулы, пайетты) ______________________
концентрация (млн. в дозе) (не менее 15 млн.) ________________
подвижность сперматозоидов, % (не менее 40) __________________
объем дозы куб. см ___________________________________________
выживаемость спермы при 38 -С, часов _________________________
общее количество непатогенных микробных тел в дозе (не более
500 м.т.) ____________________________________________________
коли-титр - (отрицательный) __________________________________
Сперма соответствует ГОСТу 26030-83 __________________________
Температура хранения отправляемой замороженной спермы ________
______________________________________________________________
Технологический паспорт (сертификат)
на сперму выдан ___________________________________
(число, месяц, год)
Ведомственный контролер (ОБК) организации ____________________
Главный технолог (зав. лабораторией) организации _____________
М.П.
|
