Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
17 октября 2005 года
Дата введения -
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2008-05
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян -
руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ
"Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзор России
(Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация
"Биозащита" (И.В. Панкин).
2. Рекомендован к утверждению Комиссией по государственному
санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе
по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека.
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия
человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г.
4. Введены впервые.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания подготовлены для
идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее -
ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей
обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с
Федеральным законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от
09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения", Законом Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в
редакции от 21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей",
Постановления Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N
322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в
сфере защиты прав потребителей и благополучия человека",
Постановления Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N
569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-
эпидемиологического надзора в Российской Федерации", Постановления
Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции
от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном
санитарно-эпидемиологическом нормировании".
1.3. Методические указания предназначены для органов и
учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль
качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых
продуктов, а также других испытательных лабораторий,
аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской
Федерации.
1.4. Методические указания разработаны для одновременного
определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров
рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО
растительного происхождения в пищевых продуктах, в том числе в
продовольственном сырье.
2. Общие положения
Методические указания содержат описание метода определения ГМО
растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора
реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного
происхождения с применением ферментного анализа на биологическом
микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с
использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной
цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизацией
продуктов этой амПЦР с применением ферментного анализа на
биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие
или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных
рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S,
nos и ocs) и двух селективных (gus, nptII). Идентификация этих
последовательностей позволяет проводить предварительную проверку
пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения.
-12
Чувствительность метода - не менее 10 г (1пг) ДНК.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты.
3.1.1. Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под
микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со
скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 -С/с
ТУ 9642-001-4648062-98.
3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических
микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003.
3.1.3. Компьютерная программа "Аrrа" для анализа изображений,
полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001".
3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными
олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 (Приложение 1 А).
3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей
температурой 42 -С, рабочий диапазон от 20 -С до 60 -С, точность
поддержания температуры +/- 1 -С ТУ 42-61961.
3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-
го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности
однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г.
3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф
вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 -С,
количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания
температуры - 0,2 -С, разность температур между соседними ячейками
- не более 0,5.
3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая
температуру минус 20 -С.
3.1.9. Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85.
3.1.10. Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой
-1
вращения не менее 13000 мин.
3.1.11. Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость
-1
вращения 250 - 3000 мин. .
3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной
воды по ГОСТ 6709-72.
3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 -
10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5% - 10,0%,
воспроизводимость 3% - 7%); 0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм,
точность +/- 2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0 -
200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5% - 2,0%,
воспроизводимость 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм,
точность +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 - 10000
куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%).
3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84
или других видов.
Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и
инструментов с аналогичными техническими характеристиками,
разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы.
3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76.
3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные
мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000
куб. см, ГОСТ 12738-77.
3.2.3. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.
3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25,
100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью
0,2; 0,5; 1,5 куб. см.
3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным
объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм.
3.3. Реактивы и реагенты.
3.3.1. Додецилсульфат натрия (SDS).
3.3.2. Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ 6-09-
11-1721-83.
3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация
"Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287.
3.3.5. Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-00.
3.3.6. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
3.3.7. Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80.
3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода.
Примечание: Допускается использование других реактивов с
аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного
производства должны иметь международный сертификат качества ИСО
9000 или EN 29000.
3.3.9. Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО
растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из
набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для
ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто
реакций.
3.3.10. Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г,
лизирующий реагент - 60 куб. см (2 флакона), сорбент - 2 куб. см
(2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 куб. см,
экстракционный раствор - 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004.
Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в
4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004
(включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая
пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и
хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед.,
200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для
проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное
масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 куб. см,
праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:
- 35S_п 5' CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA
(39 н.о.);
- 35S_o* 5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG
A (40 н.о.);
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:
- gus_ 5' АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33
н.о.);
- gus_o* 5' TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.);
праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
- nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32
н.о.);
- nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35
н.о.);
праймеры на маркерный ген nptII из транспазона Тn5
бактериального происхождения:
- npt_п 5' GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.);
- npt_o* 5' АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);
праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium
tumefaciens:
- ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32
н.о.);
- ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32
н.о.).
Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см.
Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п - обозначают
прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* -
обозначают обратные праймеры, меченные биотином; н.о. -
нуклеотидные остатки.
3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного
анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC - 50 куб. см;
диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; коньюгат пероксидазы хрена
со стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1
пробирка.
Примечание: Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня
изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную
коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2 -С до
+8 -С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 -С
хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-
пероксидазы.
4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов
4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).
В мерной колбе на 100 куб. см растворить 18,62 г
этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80
куб. см дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси
довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем
раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой
при комнатной температуре до года.
4.2. Приготовление 10%-ного раствора SDS.
Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить
при комнатной температуре не более 1 года.
4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера.
Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см)
(из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести
бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным этиловым
спиртом - до отметки 300 куб. см и перемешать. Рабочий раствор
солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при
температуре 4 -С.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам,
устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой
продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66,
13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-
85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73,
26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-
70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ
Р ИСО 2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5
куб. см внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого
материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать
при 65 -С в течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет 30
минут для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание
и др.) и до 60 мин. для зерна. Через каждые 10 - 15 минут
гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы
использовать индивидуальный наконечник).
6.2. К содержимому пробирки добавить 400 куб. мм лизирующего
реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до
максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65
-С 60 - 120 мин.
6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз
гомогенизировать, добавить 500 куб. мм бидистиллированной воды и
перемешать на вортексе.
6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.).
Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
6.5. Добавить 20 куб. мм сорбента из набора реагентов (перед
использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе).
Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут
(10 - 20 об./мин.).
6.6. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К
осадку добавить 200 куб. мм лизирующего реагента из набора
реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния.
Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g.
6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего
раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать
содержимое пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать
пробу 10 секунд при 5000 g.
6.9. Удалить супернатант не задевая осадка.
6.10. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого
буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд
при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
6.12. Подсушить осадок при 65 -С в течение 4 - 5 минут.
6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из
набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить
при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул
ионообменной смолы.
6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 - 10
секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут
при 65 -С.
6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе,
центрифугировать 1 мин. при 5000 g.
6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую
пробирку и хранить при -20 -С до проведения ПЦР анализа. При
отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка,
содержащего сорбент.
Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения
ДНК, возможно использование метода выделения с помощью СТАВ
(гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических
указаниях по определению генетически модифицированных источников в
продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной
цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически
модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения
методом полимеразной цепной реакции").
7. Амплификация
7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника
необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора
реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль",
"исследуемые пробы", "+" контроль".
7.2. Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров.
7.3. Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя.
7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем,
добавить 5 куб. мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки
добавить по 5 куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным
контролем добавить 5 куб. мм раствора контрольной ДНК.
7.5. Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла
(масло не используется в случае, если амплификатор имеет
термостатируемую крышку).
7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в
термоблок программируемого термостата и запустить программу
амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1.
Таблица 1
ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР
------------------T---------------T---------------T--------------¬
¦ Шаг программы ¦Температура -С ¦ Время ¦ Количество ¦
¦ ¦ ¦инкубации, сек.¦ циклов ¦
+-----------------+---------------+---------------+--------------+
¦1. ¦94 ¦180 ¦1 ¦
+-----------------+---------------+---------------+--------------+
¦2. ¦94 ¦30 ¦42 ¦
+-----------------+---------------+---------------+ ¦
¦3. ¦62,5 ¦30 ¦ ¦
+-----------------+---------------+---------------+--------------+
¦4. ¦72 ¦180 ¦1 ¦
L-----------------+---------------+---------------+---------------
Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей
рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо иметь
отдельный комплект микродозаторов, не используемых при
пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При
подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают
только перед отбором или внесением проб, а по окончании
манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно
несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на
длительное время.
7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать
в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы
для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в
случае его использования.
7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением
ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении
не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в
высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми
помещений, оборудования и реактивов может привести к получению
ложноположительных результатов.
8. Проведение ДНК гибридизации
8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl,
0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC,
0,1% SDS; 0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора можно
воспользоваться таблицей 2.
Таблица 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC
--------------------T-------------T----------------T-------------¬
¦ Раствор ¦ 20хSSC ¦ 10%-ный SDS ¦ Н О дист. ¦
¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦
+-------------------+-------------+----------------+-------------+
¦2xSSC, 0,1% SDS ¦10 куб. см ¦1 куб. см ¦89 куб. см ¦
+-------------------+-------------+----------------+-------------+
¦0,1хSSC ¦0,5 куб. см ¦- ¦99,5 куб. см ¦
+-------------------+-------------+----------------+-------------+
¦0,1xSSC, 0,1% SDS ¦0,5 куб. см ¦1 куб. см ¦98,5 куб. см ¦
+-------------------+-------------+----------------+-------------+
¦0,01хSSC ¦0,05 куб. см ¦- ¦99,95 куб. см¦
L-------------------+-------------+----------------+--------------
8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК
центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и
держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую
микропробирку 5 куб. мм 20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать и
центрифугировать 1 - 2 секунды. Распределить полученную смесь по
поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных
олигонуклеотидов.
8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку
Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и
поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 -С.
8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и
затем тщательно промыть чип следующими растворами:
- 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут;
- 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут;
- 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте;
- 0,01хSSC в течение 10 секунд.
9. Проведение ферментного анализа
9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в
200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный
альбумин), из расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо
проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125
куб. мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб.
мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм 1хSSC,
а затем добавляют 0,75 куб. мм исходного конъюгата.
9.2. Нанести 25 - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую
зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при
комнатной температуре.
9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
9.4. Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут.
9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор
субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку
ДАБ в 1 куб. см буфера 0,1хSSC, добавить 30 куб. мм 3%-ного
раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать
немедленно.
9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и
выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае
положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного
субстрата.
9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли
воды и поместить в термостат 42 -С на 5 - 10 минут. После сушки
микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
10. Сканирование биологических микрочипов
10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации,
поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом
"ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе.
10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования,
зафиксировать его и закрыть рамку.
10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в
диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к
сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в
приемное окно детектора.
10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо
сохранить изображение (Приложение 1 Б), присвоив файлу
соответствующее имя.
10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует
нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
11. Анализ изображений биочипов
11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа
"Аrrа".
11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого
нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В
появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены
изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего
изображение появится в основном окне программы.
11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить
центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в
изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем -
"Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования
прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры
узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой
мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку
нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося
прямоугольника в центр нижнего правого узла.
11.4. В результате предварительной разметки на экране появится
четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно,
в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно
нажать клавишу "Принять".
11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую
коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция
"Настройки/Автоматическая подстройка".
11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ"
- "Показать результаты".
11.8. По окончании измерений программа предоставляет
возможность подготовки и распечатки протокола испытаний
(Приложение 2). Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем
- "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для
заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку
"Выход".
12. Интерпретация результатов
12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Аrrа
оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах
гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды,
указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о
наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце
(пробе).
12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех
пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные
олигонуклеотиды, указывает на не содержание рекомбинантной ДНК,
что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не
имеет ГМО растительного происхождения.
12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при
использовании отрицательного контроля амплификации,
свидетельствует о получении ложноположительного результата.
Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В
этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов
и оборудования раствором 1 H соляной кислоты, заменить реактивы на
свежеприготовленные и повторить анализ.
12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании
положительного контроля амплификации свидетельствует о получении
ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря
активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или
гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом
микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на
свежеприготовленные и повторить анализ.
13. Организация рабочих мест
Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных
в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с
МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных
источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной
цепной реакции".
Приложение 1
ПРИМЕР ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР
НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
А
--------------------------------------------------T--------------¬
¦ 35S gus nos nрtII ocs ¦ М.П. ¦
¦ ¦ ¦
¦ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ L----- L----- L----- L----- L----- ¦ ¦
¦ -----¬ -----¬ ¦ ¦
¦ ¦K(-)¦ ¦K(-)¦ ¦ ¦
¦ L----- L----- ¦ ¦
¦ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ ¦ ¦
¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦K(+)¦ ¦ ¦
¦ L----- L----- L----- L----- L----- ¦ ¦
¦ ¦ ¦
L-------------------------------------------------+---------------
Б
--------------------------------------------------T--------------¬
¦ 35S gus nos nрtII ocs ¦ М.П. ¦
¦ ¦ ¦
¦ -----¬ -----¬ ¦ ¦
¦ ОП ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ L----- L----- ¦ ¦
¦ ¦ ¦
¦ К- ¦ ¦
¦ ¦ ¦
¦ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ -----¬ ¦ ¦
¦ К+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ L----- L----- L----- L----- L----- ¦ ¦
¦ ¦ ¦
L-------------------------------------------------+---------------
А - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации
ГМИ растительного происхождения;
Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в
результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей
промотор 35S и терминатор nos.
Приложение 2
ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
Серия АБ N 0000000
N _________ от "__" __________ 200_ г.
Продукция ____________________________________________________
Производитель сырья или продукции ____________________________
Предъявитель сырья или продукции _____________________________
Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом
на соответствующую группу сырья или продукции ________________
Акт отбора проб и техническое задание на испытания N __ от ___
Испытания проведены на основании требований
Номер образца ________________________________________________
Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и
состояние упаковки, этикетки, штрих-кода)
в образцах N ____ отсутствует, а в образце N ____ присутствует
Маркировка: __________________________________________________
Годен до ________________ Штриховой код ______________________
Результаты испытаний
----------T------------------------------------------------------¬
¦ Номер ¦ Трансгенные последовательности ¦
¦ образца +------------T-----------T------------T--------T-------+
¦ ¦ 35S ¦ gus ¦ nos ¦ nptII ¦ ocs ¦
+---------+------------+-----------+------------+--------+-------+
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L---------+------------+-----------+------------+--------+--------
Результаты анализа ___________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
Исполнители:
_____________________ _____________________
(подпись) (подпись)
_____________________ _____________________
(подпись) (подпись)
Руководитель испытательной лаборатории _______________________
(подпись)
М.П. _______________________
(Фамилия, инициалы)
Заключение распространяется на образец, представленный на
испытания.
НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от
09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии
населения".
2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в
редакции от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей".
3. Постановление Правительства Российской Федерации от
24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении
Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом
нормировании".
4. Постановление Правительства Российской Федерации от
15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного
санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации".
5. Постановление Правительства Российской Федерации от
30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека".
6. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 08.11.2000 N 14 "О порядке проведения
санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции,
полученной из генетически модифицированных источников".
7. Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за
пищевыми продуктами, полученными из ГМИ".
8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые
продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности
пищевых продуктов".
9. ГОСТ 5904-82с "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы
отбора и подготовки проб".
10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски".
Технические условия".
11. ГОСТ 12292-2000 "Консервы рыбные с растительными гарнирами.
Технические условия".
12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы
отбора проб".
13. ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы
отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе".
14. ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей.
Правила приемки, методы отбора проб".
15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и
методы отбора проб".
16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора
проб".
17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора
проб".
18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины,
баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц.
Правила приемки и методы отбора проб".
19. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские
беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки,
органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для
лабораторных испытаний".
20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила
приемки и методы отбора проб".
21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора
проб".
22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
23. ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными
добавками. Технические условия".
24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки,
методы отбора и подготовка проб к анализу".
25. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора
проб".
26. ГОСТ 27853-88 "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды
моченые. Приемка, отбор проб".
27. ГОСТ 28741-90 "Продукты питания из картофеля. Приемка,
подготовка проб и методы испытаний".
28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
29. ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и
поставках".
30. ГОСТ 15877-70 "Кукуруза сахарная консервированная.
Технические условия".
31. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при
поставках. Технические условия".
32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
33. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
34. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
35. ГОСТ Р 51926-2002 "Консервы. Икра овощная. Технические
условия".
36. ГОСТ ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых
продуктов".
|
