УТВЕРЖДАЮ
Заместитель Министра
здравоохранения и
социального развития
Российской Федерации
Р.А.ХАЛЬФИН
4 августа 2006 г. N 4174-РХ
ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ НА ВИЧ-ИНФЕКЦИЮ
(В ТОМ ЧИСЛЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНИТЕТА И ВИРУСНОЙ
НАГРУЗКИ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ)
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПИСЬМО
Настоящее методическое письмо подготовлено Министерством
здравоохранения и социального развития Российской Федерации в
соответствии с условиями Соглашения между Российской Федерацией и
Международным банком реконструкции и развития о займе для
финансирования проекта "Профилактика, диагностика, лечение
туберкулеза и СПИДа" N 4687-RU в рамках подготовки нормативно-
правовых актов и методических документов по вопросам диагностики,
лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и
сопутствующих заболеваний (приказ Минздравсоцразвития России от 1
апреля 2005 г. N 251 "О создании рабочей группы по подготовке
нормативных правовых актов и методических документов по вопросам
диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора
ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний)") при участии ФГУ
"Федеральный научно-методический центр по профилактике и борьбе со
СПИДом Роспотребнадзора" (Буравцова Е.В., к.м.н. Серебровская
Л.В., к.б.н. Круглова А.И.).
Методическое письмо предназначено для специалистов лечебно-
профилактических учреждений, проводящих лабораторную диагностику
ВИЧ-инфекции, а также для врачей-интернов, клинических
ординаторов, аспирантов по специальностям "Клиническая
лабораторная диагностика", "Инфекционные болезни", "Кожные и
венерические болезни", "Акушерство и гинекология", "Урология",
"Врач общей практики".
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИФА Иммуноферментный анализ
ИБ Иммунный блот
ЛИА Линейный иммунный анализ
ПГА Пассивная гемагглютинация
АЛ Агглютинация латекса
ВИЧ Вирус иммунодефицита человека
СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита
ВААРТ Высокоактивная антиретровирусная терапия
ФЭУ Фотоэлектронные умножители
FSC Прямое светорассеяние (Forward Scatter)
SSC Боковое светорассеяние (Side Scatter)
CDC Центр контроля заболеваемости
PLG Методика гейтирования всех лейкоцитов (Panleukogating)
РМТ см. ФЭУ
CV Коэффициент вариации
MdX Медиана по оси X
ПЦР Полимеразная цепная реакция
ГИФА Гибридизационно-ферментный анализ
ОТ обратная транскрипция
ВКО внунтренний контрольный образец
ПКО положительный контрольный образец
кДНК комплиментарная ДНК
ТМБ тетраметилбензидин
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
MuLV Moloney Murine Leukemia Virus (вирус лейкоза мышей)
AMV Avian myeloblastosis virus (вирус миелобластоза птиц)
NASBA Nucleic Acids Sequence Based Amplification
(изотермальная амплификация)
bDNA branched DNA (разветвленная ДНК-гибридизация)
ЧАСТЬ 1. ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ
НА ВИЧ-ИНФЕКЦИЮ
Введение
В соответствии с Федеральном законом от 30 марта 1995 г. N 38-
ФЗ "О предупреждении распространения в Российской Федерации
заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-
инфекции") государством гарантируется доступность медицинского
освидетельствования для выявления ВИЧ-инфекции, в том числе и
анонимного, с предварительным и последующим консультированием
(статья 4).
Статья 7 вышеуказанного закона предусматривает что:
"Медицинское освидетельствование проводится в учреждениях
государственной муниципальной и частной системы здравоохранения и
включает в себя, в том числе, соответствующее лабораторное
исследование, которое проводится на основании лицензии,
предоставленной в порядке, установленном законодательством
Российской Федерации"; "Выдача официального документа о наличии
или об отсутствии ВИЧ-инфекции у освидетельствуемого лица
осуществляется только учреждениями государственной или системы
здравоохранения".
Проведению диагностики ВИЧ-инфекции должно предшествовать
консультирование обследуемого, которое играет одновременно и
терапевтическое и противоэпидемическое значение. Консультация
психологически подготовляет пациента к сообщению о диагнозе ВИЧ-
инфекции, способствует улучшению последующего взаимопонимания
больного с медицинским персоналом и имеет большое значение для
предупреждения возможного дальнейшего распространения ВИЧ.
Основные методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции включают
выявление вирусных антигенов и антител к ВИЧ. Специфические
антитела к ВИЧ образуются вскоре после инфицирования, однако
точное время их появления зависит от характеристики организма
хозяина и вируса. Антитела могут присутствовать на ранних стадиях
инфекции, но их концентрация может быть ниже предела
чувствительности используемых методов. При применении тестов
первого поколения антитела можно было обнаруживать у большинства
лиц через 6-12 недель после инфицирования. Тесты новых поколений,
включая тесты третьего поколения с использованием сэндвича
антигенов, могут выявлять антитела уже через 3-4 недели после
инфицирования. Скрытый период, "период окна", можно сократить на
несколько дней, используя тесты для выявления антигена, и еще на
несколько дней путем определения провирусной ДНК вируса. Поэтому
период "окна" может иметь продолжительность 2-3 недели, если
использовать всестороннюю стратегию выявления ВИЧ. Большинство
методов определения антител, обладают близкой к 99,5%
чувствительностью для выявления большинства лиц, инфицированных
ВИЧ (эпидемиологическая чувствительность), однако эти методы
отличаются по своей способности выявлять низкие концентрации
антител (аналитическая чувствительность метода), например в период
до полной сероконверсии. Хотя существуют методы для выявления
специфических антител к ВИЧ класса IgM, но эти тесты не нашли
широкого применения для выявления ранней инфекции, поскольку
образование IgM в ответ на ВИЧ не является воспроизводимым на
ранних стадиях инфекции. Способность некоторых методов (тесты
третьего поколения) выявлять антитела класса IgM одновременно с
антителами класса IgG приводит к более высокой аналитической
чувствительности таких тестов. Тесты последнего поколения,
выявляющие одновременно антигены и антитела к ВИЧ, позволяют еще
больше повысить аналитическую чувствительность метода.
Преимущества проведения исследования, как на присутствие антител,
так и антигенов, оправдываются необходимостью выявлять лиц как с
уже выраженной инфекцией, так и на ранних стадиях ВИЧ инфекции не
только среди доноров крови, но и среди других групп населения.
Раннее выявление инфекции за счет анализа на антиген способствует
быстрому направлению ВИЧ-инфицированных лиц на консультирование,
но и позволяет осуществлять мероприятия, связанные с
профилактикой. ИФА четвертого поколения благодаря способности
выявлять антиген p24 представляют ценность для выявления инфекции
на ранних стадиях. Важно отметить, что высокий уровень
аналитической и эпидемиологической чувствительности,
продемонстрированный большинством тестов четвертого поколения при
исследовании лиц с сероконверсией, а также при исследовании
различных групп больных ВИЧ, делает их идеальными для применения в
целом ряде ситуаций для диагностики как ранней, так и уже
установившейся инфекции. В стандартных лабораторных условиях
образцы, содержащие ВИЧ, могут быть идентифицированы за счет
определения антигена, в то время как это было бы невозможно при
использовании обычного скрининга на антитела.
Стандартным методом диагностики ВИЧ-инфекции служит определение
антител к ВИЧ с помощью ИФА. Этот метод очень надежен, его
чувствительность составляет более 99,5%. В большинстве
диагностических лабораторий для проведения этого исследования
используются коммерческие наборы, позволяющие определять антитела
к ВИЧ обоих типов, набор антигенов в этих тестах постоянно
обновляется, что позволяет повысить их чувствительность при
определении антител к новым штаммам ВИЧ. При лабораторной
диагностике ВИЧ выявление специфических антител говорит о том, что
инфицирование произошло. Для правильности диагноза, однако,
необходимо использовать тесты, которые эффективны для выявления
ВИЧ антител, а не антител к другим инфекционным агентам, которые
могут быть в антигенном отношении сходными с ВИЧ. Антигены,
применяемые в диагностических тестах на ВИЧ, должны обладать
достаточной специфичностью и обычно представляют собой очищенные
антигены из вирусных лизатов или антигены, полученные с помощью
рекомбинантной технологии или технологии синтетических пептидов.
Тесты с использованием таких антигенов для скрининга на ВИЧ
обладают как высокой чувствительностью (для выявления инфекции),
так и специфичностью (для выявления неинфицированных больных).
Результаты анализа обычно расцениваются как положительные и
отрицательные. Хотя тесты, используемые для скрининга, являются
чувствительными, у них отсутствует достаточная степень
специфичности. Причинами ложноположительного результата могут быть
наличие в сыворотке антител к аутоантигенам HLA класса II и другим
аутоантигенам, болезни печени или недавняя вакцинация и так далее.
Поэтому сыворотки, дающие воспроизводимо положительный результат в
ходе скрининга, должны быть проверены с использованием
подтверждающего метода (иммунный блот) или группы подтверждающих
методов.
Иммуноферментный анализ (ИФА) (ELISA)
Методы иммуноферментного анализа (ИФА) широко используются для
скрининга на наличие антител к ВИЧ. Методы ИФА основаны на простой
методологии, обладает высокой чувствительностью и пригодны для
исследования большого числа образцов. Общим свойством всех
вариантов ИФА является использование ферментных конъюгатов,
связанных со специфическим антителом или антигеном ВИЧ, и
субстрата/хромогенов, дающих окраску в реакции, катализируемой
связанным ферментным конъюгатом. Наиболее широко применяемые ИФА-
тесты основаны на непрямом методе, когда ВИЧ антигены
присоединяется к дну лунки 96-луночного планшета или к
макроскопической сфере, которая затем помещается в лунку на таком
планшете. Антитела, присутствующее в образце, реагирует с твердым
носителем, покрытым антигеном, обычно в течение 30 минут при 37
град. C или 40 град. C. После отмывки несвязанных компонентов
сыворотки добавляют конъюгат (иммуноглобулин против
иммуноглобулина человека с конъюгированным ферментом) - он
связывается со специфическими антителами, которые присоединились к
антигенам, находящемся на твердой фазе. Затем добавляют
соответствующий субстрат, что приводит к развитию окрашивания,
которое измеряется с помощью спектрофотометра, пропорционального
концентрации специфических антител к ВИЧ, находящихся в
анализируемом образце. Поскольку окрашенный раствор поглощает
проходящий через него свет, регистрируется оптическая плотность,
являющаяся количественной мерой степени окраски, пропорциональной
количеству связанных антител (т.е. концентрации антител).
Использование метода с антигеном, нанесенным на сферу, не имеет
каких-либо серьезных преимуществ по сравнению с использованием
просто планшета для микротитрования; применение того или иного
варианта - вопрос предпочтения лаборатории. Оба метода могут быть
полностью автоматизированы, причем стоимость также является
одинаковой. В нескольких методах непрямого ИФА используются
поливалентные конъюгаты (как с анти-IgG, так и анти-IgM) для
повышения чувствительности метода с целью выявления ранней стадии
ВИЧ инфекции (на этапе сероконверсии). Конкурентный метод ИФА, при
котором специфические антитела к ВИЧ в образце конкурируют со
связанными с ферментом антителами за антигенные места посадки на
твердой фазе. При использовании этого метода степень развития
окраски обратно пропорциональна концентрации специфических
антител, "сендвич" метод основан на принципе когда, антитело,
находящееся в образце, затем вставляется в виде "сэндвича" между
двумя молекулами антигена, одна из которых иммобилизована на
твердой фазе, а другая соединена с ферментом. На следующем этапе
добавление субстрата приводит к развитию окраски пропорционально
концентрации антител. Вариант ИФА с использованием "сэндвича"
антигенов является наиболее чувствительным методом для скрининга с
учетом его способности выявлять все изотипы антител (включая IgM).
Новое поколение, комбинированных ИФА-тесты, одновременно выявляют
как антиген, так и антитела. Преимуществами этих тестов является
сокращение времени, необходимого для анализа, снижение трудозатрат
и большая экономичность, по сравнению с тем, когда каждый из
анализов выполнялся индивидуально. Эти тесты продемонстрировали
высокую аналитическую чувствительность выявления, которая связана
с использованием комбинации метода третьего поколения ("сэндвича"
антигенов) для выявления антител и одновременного выявления p24
антигена ВИЧ.
Быстрые тесты
Быстрые тесты для определения специфических антител к ВИЧ - это
тесты, которые можно выполнить менее, чем за 30 минут. При
правильном исполнении быстрые тесты на антитела к ВИЧ являются
точными и имеют широкое применение в целом ряде ситуаций. Области
их применения: трансплантология - перед забором материала,
эпиднадзора - обследование труднодоступных групп населения,
обследование крови, в случае экстренного переливания препаратов
крови и отсутствия обследованной на антитела к ВИЧ крови;
тестирование на ВИЧ (если требуется немедленное начало
медикаментозной профилактики ВИЧ в случае аварийной ситуации);
тестирование беременных женщин с неизвестным ВИЧ-статусом в
предродовом периоде.
Виды быстрых тестов:
Мембранные устройства для концентрации иммунного материала. В
результате выполнения этих анализов образуется четко видимая
окрашенная точка на твердой поверхности, если анализ дает
положительный результат. Некоторые варианты таких тестов содержат
две точки, что позволяет дифференцировать инфекцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Процедуры, используемые для анализов, являются сходными,
независимо от конкретной реализации этого метода. В большинстве
методов требуется покапельное добавление реактивов в следующей
последовательности: буфер, образец, промывной буфер, конъюгат,
промывной буфер, субстрат и стоп-раствор. В некоторых тестах
используется краситель, связывающийся с IgG (реактив,
представляющий собой конъюгат белка А с золотом) вместо
антииммуноглобулинового конъюгата, в результате последовательность
операций уменьшается на один этап. Большинство быстрых тестов в
настоящее время содержит внутренний контроль, который показывает,
что анализ был выполнен корректно. Этим контролем является
иммуноглобулин против иммуноглобулина человека, который связывает
любой иммуноглобулин, присутствующий в образце, и дает отдельную
точку, если все реактивы были добавлены надлежащим образом.
Иммунохроматографический метод (латеральная Диффузия). Кровь,
жидкость или сыворотка помещается на кончик устройства, далее
происходит диффузия вдоль полоски, которая пропитана реактивами
(часто это Белок А с коллоидным золотом), далее происходит реакция
антител с антигеном; в некоторых тестах используется методология
третьего поколения (сэндвич антигенов). С помощью таких тестов
результаты могут быть получены менее чем за 10 минут (в некоторых
случаях в пределах 2 минут). Метод не требует добавления
реактивов, или требуется добавления только буфера. В эти тесты
также введен компонент, предназначенный для контроля технических
ошибок. Некоторые из таких тест-наборов можно хранить в широком
интервале температур (от 15 град. до 30 град. C и легко
транспортировать.
Простые тесты
Такие типы тестов на наличие антител к ВИЧ требуют более 30
минут для проведения исследования, но в них применяются процедуры,
которые легко выполняются в отсутствие приборного обеспечения. К
этому классу тестов относятся тесты на основе агглютинации, когда
частицы, покрытые антигеном (эритроциты, частицы латекса или
частицы желатина) реагируют с антителами сыворотки, образуя
видимую агглютинацию (образование комочков). При использовании
эритроцитов методику называют пассивной гемагглютинацией (ПГА);
при использовании частиц латекса методику называют методом
агглютинации латекса (АЛ).
Иммунный блот
Иммунный блот (ИБ) представляет собой наиболее широко
применяемый подтверждающий метод для выявления антител к
ретровирусам; большинство авторитетных исследователей в этой
области считают его "золотым стандартом" для подтверждения
результатов в отношении ВИЧ. Метод основан на использовании
электрофореза для разделения антигенов ВИЧ, полученных из
вирусного лизата. Это позволяет денатурировать компоненты вируса,
придает им отрицательный заряд и разделяет их преимущественно на
основании молекулярного веса. Разделение антигенов позволяет
выявлять специфические антитела к каждому из антигенов вируса в
ходе проведения исследования сходного с методикой
иммуноферментного анализа. Смесь очищенных антигенов ВИЧ наносят
на блок геля, содержащего додецилсульфат натрия и полиакриламид,
после чего проводится электрофорез. Вирусные белки (антигены ВИЧ)
мигрируют через молекулярные поры геля со скоростями, которые
определяются электрическим зарядом и молекулярным весом; более
высокомолекулярные белки мигрируют на меньшее расстояние и
образуют полосу, находящуюся ближе к точке старта. Белки,
разделенные в геле, затем переносят (осуществляется их "блоттинг")
на нитроцеллюлозу с помощью другой процедуры электрофореза.
Нитроцеллюлозная мембрана разрезается на тонкие полоски, каждая из
которых содержит полное распределение полос антигенов,
соответствующих вирусным белкам. Индивидуальная тест полоска
инкубируется с разведением исследуемого образца или контроля,
после чего отмывается и инкубируется с коньюгатом. Меткой обычно
является фермент (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза),
который реагирует со специфическим бесцветным субстратом с
образованием нерастворимого окрашенного вещества (окрашенной
полосы на полоске) в тех местах, где присутствует комплекс антиген-
антитело. Реакция с положительным образцом сыворотки дает набор
полос на полоске, который характерен для ВИЧ. Многие из этих полос
идентифицированы со специфическими продуктами вирусных генов.
Вирусные антигены ВИЧ-1 разделяются на следующие компоненты
(сверху вниз): gpl60, gpl20, p68, p55, p51, gp41, p31, p25, p18.
Обозначение "gp" относится к гликопротеидам; "p" означает белки.
Цифры обозначают молекулярные веса. Важно помнить, что невирусные
белки, происходящие из клеток хозяина, в которых выращивают вирус,
также присутствуют на полоске нитроцеллюлозы. Они могут
образовывать полосы во многих местах, однако чаще находятся вблизи
средних значений молекулярного веса (40,000-60,000). Наличие этих
невирусных белковых полос может создавать трудности при
интерпретации результатов за счет неспецифических реакций.
Интерпретация результатов
В зависимости от присутствующих в образце конкретных антител,
реагирующих с разделенными антигенами ВИЧ, получаются разные
профили полос. Тип профиля (комбинация и интенсивность
присутствующих полос) определяет, является ли лицо, сыворотка
которого анализируется, положительным в отношении антител к ВИЧ.
Классификация результатов Вестерн блота определяется рядом
критериев. Рекомендации Центра по контролю за заболеваниями (CDC)
используют для вывода о положительном результате наличия
реагирования по крайней мере со следующими антигенами: p25, gp41,
gpl20/160. В настоящее время является общепринятым, что
отрицательным результатом является отсутствием всех полос.
Рекомендации ВОЗ требуют для вывода о положительном результате
наличия реагирования по крайней мере для следующих антигенов: 2
белка их env (gpl20 и gp160, gpl20 и gp41, gp160 и gp41 +/- другие
белки). ВОЗ придерживаются мнения, что результаты могут считаться
отрицательными, если присутствует только очень слабая полоса p17.
Вывод о неопределенных результатах делается, когда присутствует
один или несколько антигенов, которые, однако, не удовлетворяют
критериям положительного результата. Сыворотки ряда
неинфицированных лиц могут реагировать с одним или несколькими
антигенами при исследовании в иммунном блоте. Такую реакцию могут
давать до 15% нормальных неинфицированных лиц, и это часто
происходит у лиц, которые оказались отрицательными при
исследовании в ИФА. Соответственно, если сыворотки, дающие
отрицательные результаты при исследовании в ИФА, тестировать в ИБ,
некоторые из таких сывороток могут давать неопределенный
результат. Большинство сывороток, дающих неопределенный результат,
обнаруживают лишь слабую реакцию в отношении белков gag (обычно
p18, p25 и/или p55); бывают и другие комбинации, но они являются
нечастыми. У некоторых лиц с неопределенными результатами
(например, реакции с p25 и p55) впоследствии происходит
сероконверсия; это свидетельствует о том, что наличие профиля,
состоящего из p25 и p55, может быть индикатором ранней инфекции.
Наоборот, у других лиц с аналогичным профилем, наблюдавшимся в
течение длительных сроков (годы), сероконверсия никогда не
происходила (т.е. они не являются инфицированными). По существу,
большинство неопределенных результатов, получаемых при
исследовании в ИБ, связаны с неинфицированными лицами, которые
дают профиль p25 и/или p55. Поэтому неопределенный результат ИБ не
может предсказывать ранние стадии инфекции. Лица, дающие
неопределенный результат в ИБ, должны быть подвергнуты повторному
тестированию через несколько месяцев, хотя сероконверсия может
быть обнаружена через более короткое время. Если это возможно,
повторное тестирование в более поздний срок должно выполняться
параллельно с повторным определением исходного образца в одном и
том же опыте с одним и тем же набором и в одинаковых условиях
определения, чтобы гарантировать возможность прямого сравнения
образцов. Всемирная организация здравоохранения рекомендует
повторное тестирование через 2 недели, если исходно получены
"подозрительные профили" в ИБ, хотя другие организации рекомендуют
подождать от 1 до 6 месяцев перед проведением повторного анализа.
Если повторное тестирование выполняется в течение 6 месяцев и
результаты становятся отрицательными или если не имеется
прогрессии в отношении характера полос, инфекцию ВИЧ, как правило,
можно исключить. Вследствие причин, которые остаются непонятными,
у многих лиц неопределенные результаты сохраняются на протяжении
многих лет, но эти лица не являются инфицированными. Если имеет
место серологическая прогрессия (большее число положительных полос
или более интенсивные полосы) или имеет место конверсия к
положительному результату (сероконверсия) при повторном анализе,
то это означает, что соответствующее лицо было вероятно
инфицировано на момент первого анализа (ранняя инфекция). Следует
отметить, что лица, вакцинированные против ВИЧ (например,
субъединицей gp160), могут неправильно выявляться как
положительные на основании реакции только с антигенами оболочки
вируса. Значение неопределенного результата при исследовании в ИБ
находится в зависимости от факторов риска, клинического состояния
больного и полученного профиля полос. Лица из групп высокого риска
имеют большую вероятность сероконверсии при повторных
исследованиях, поскольку вероятность их инфицирования является
высокой. Отдельные типы профилей ИБ являются более надежными
индикаторами ранней инфекции (например, наличие p25, р31 и p55),
чем другие (например, только p18). Многие исходно неопределенные
результаты, которые в последующем стали отрицательными или
остаются неопределенными, вероятно являются результатом
неспецифических реакций, гипергаммаглобулинемии, наличия
перекрестно реагирующих антител, инфекции ВИЧ-2 или инфицирование
неизвестным, но родственным ретровирусом. Аутоиммунные заболевания
(например, системная красная волчанка) могут вызывать ложно-
положительные результаты анализов при исследовании на наличие
антител к ВИЧ, в том числе и в ИБ (34). Также необходимо помнить,
что отдельные лица с поздними стадиями заболевания могут терять
реактивность в отношении p25, а возможно и антитела, реагирующие с
другими белками вируса, поэтому больные на более поздних стадиях
заболевания могут давать неопределенные результаты при
исследовании в ИБ. При неопределенном результате исследования в ИБ
для решения вопроса инфицирования ВИЧ могут потребоваться
дополнительные исследования.
Линейный иммунный блот
Альтернативой классическому иммунному блоту является "линейный"
иммунный анализ (ЛИА). В этом методе рекомбинантные антигены или
синтетические полипептидные антиген ВИЧ-1 и ВИЧ-2 наносят на
полоску нитроцеллюлозы, а не подвергают электрофорезу, как это
делается в ИБ. Такое использование "искусственных" антигенов
уменьшает наличие контаминирующих веществ из клеточной культуры,
которые могут давать ложные реакции. Подтверждено, что
чувствительность и специфичность этих тестов соответствует
чувствительности и специфичности классического иммунного блота.
Диагностика ВИЧ-2
В биологическом отношении ВИЧ-2 весьма сходен с ВИЧ-1: геном
ВИЧ-2 имеет примерно 60% гомологию с ВИЧ-1 в более консервативных
генах gag и pol и 30-40% гомологию в других вирусных генах и
последовательностях LTR. Антигены ВИЧ-2 сходны с антигенами ВИЧ-1,
но их молекулярные массы могут несколько отличаться. Например,
белки gag (p) ВИЧ-2 обозначаются как р56, р26 и р16; белки pol p68
и р34; гликопротеины оболочки (gp) gp36 (или gp41), gpl40 и gp105.
Как и в случае тестов для скрининга на ВИЧ-1, существует целый ряд
вариантов для выявления антител к ВИЧ-2, включая ИФА, ИБ и
быстрые/простые тесты. Для диагностики ВИЧ-2 с 1991 года
используются "комбинированные тесты" на ВИЧ-1/2, которые содержат
антигены обоих вирусов.
Сбор, хранение и транспортировка образцов для
проведения исследования
Способы сбора, условия хранения и транспортирования материала
для проведения тестирования по определению чувствительности ВИЧ к
лекарственным препаратам должны соответствовать требованиям СП
1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов I-IV групп патогенности".
Забор крови для серологического обследования на антитела к ВИЧ
производится из локтевой (или другой) вены в чистую сухую пробирку
в количестве 3-5 мл. Полученный материал (цельную кровь) нельзя
замораживать, кроме того, его не рекомендуется хранить более 12
часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при
4-8 град. C.
Происходящий при неправильном хранении гемолиз может повлиять
на результаты анализа. Сыворотка отделяется центрифугированием или
обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой либо
стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую
(лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в
таком виде она может храниться до 7 дней при температуре 4-8 град.
C, в замороженном виде несколько лет. При работе следует соблюдать
правила техники безопасности согласно Санитарным правилам
"Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп
патогенности и гельминтами" (Постановление Главного
государственного Санитарного врача Российской Федерации от 3
февраля 1999 г. N 4).
Диагностический алгоритм тестирования на наличие
антител к ВИЧ
В России в настоящее время стандартной процедурой лабораторной
диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к ВИЧ с
последующим подтверждением их специфичности в реакции иммунного
блоттинга. В последние годы стало широко применятся новое
поколение комбинированных ИФА-тесты, одновременно выявляющих как
антиген, так и антитела. Преимуществами этих тестов является
сокращение времени, необходимого для анализа, снижение трудозатрат
и большая экономичность, по сравнению с тем, когда каждый из
анализов выполнялся индивидуально. Эти тесты продемонстрировали
высокую аналитическую чувствительность выявления, которая связана
с использованием комбинации метода третьего поколения (сэндвич
антигенов) для выявления антител и одновременного выявления p24
антигена ВИЧ. ИФА четвертого поколения благодаря способности
выявлять антиген p24 представляют ценность для выявления инфекции
на ранних стадиях.
Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа. На первом этапе
проводится выявление суммарного спектра антител против антигенов
ВИЧ с использованием различных тестов: иммуноферментных,
агглютинационных, комбинированных, гребеночных, мембранно-
фильтрационных или мембранно-диффузных. На втором этапе методом
иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным
антигенам вируса. В работе допустимо использование только тест-
систем, разрешенных к применению Министерством здравоохранения и
социального развития РФ. Диагностические процедуры должны
проводиться только в соответствии с утвержденными инструкциями по
применению соответствующих тестов.
На первом этапе (скрининговая лаборатория)
Если получен положительный результат, анализ проводится
последовательно еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-
системе). Если при этом был получен еще хотя бы один положительный
результат (два положительных результата из трех постановок в ИФА)
сыворотка считается первично-положительной и направляется в
референс-лабораторию для дальнейшего исследования.
На втором этапе (референс-лаборатория)
В референс-лаборатории первично положительная сыворотка, (то
есть давшая два положительных результата в первой тест-системе)
повторно исследуется в ИФА во второй (другой) тест-системе,
выбранной для подтверждения.
При получении положительного результата анализа и во второй
тест-системе сыворотку необходимо исследовать в ИБ или линейном
блоте.
При получении отрицательного результата во второй тест-системе
сыворотка повторно исследуется в третьей тест системе.
В случае получения отрицательного результата анализа и во
второй и в третьей тест-системе выдается заключение об отсутствии
антител к ВИЧ. При получении положительного результата в третьей
тест-системе сыворотка также направляется на исследование в ИБ или
линейном блоте. Результаты, полученные в подтверждающем тесте (ИБ,
ЛИА), интерпретируются, как положительные, неопределенные и
отрицательные.
Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых
обнаруживаются антитела к 2 или 3 гликопротеинам ВИЧ.
Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не
обнаруживается антител ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или
имеется слабое реагирование с белком p18.
Неопределенными (сомнительными) считаются сыворотки, в которых
обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-
либо протеинам ВИЧ.
При получении неопределенного результата с белковым профилем
включающим белки сердцевины (gag) проводится исследование для
диагностики ВИЧ-2.
При получении положительного результата в подтверждающем тесте
(ИБ, ЛИА) делается заключение о наличии в исследуемом материале
антител к ВИЧ.
При получении отрицательного результата анализа в
подтверждающем тесте (ИБ, ЛИА) выдается заключение об отсутствии
антител к ВИЧ.
При получении неопределенного результата проводятся повторные
исследования на антитела к ВИЧ в зависимости от белкового профиля.
При получении "подозрительные белкового профиля" в ИБ повторные
исследования необходимо проводить через 2 недели, а затем через 3
месяца еще через 3 месяца от момента первого исследования. Если
через 3 или 6 месяцев получен отрицательный результат в ИФА, то
дальнейшее исследование не требуется. Если через 6 месяцев после
первого обследования вновь будут получены неопределенные
результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения
и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как
ложноположительный. (При наличии эпидемиологических и клинических
показаний серологические исследования повторяются по назначению).
При возможности можно использовать дополнительные методы
диагностики, такие как определение p24 антигена или ПЦР
исследования. Если был выявлен антиген p24 или ДНК/PHК ВИЧ
повторное обследование, на наличие антител, проводится через 2
недели после получения первого неопределенного результата и в
дальнейшем через каждые 2 недели до получения положительного
результата в подтверждающем тесте.
При использовании тестов одновременно выявляющих антиген и
антитела к ВИЧ на втором этапе (референц-лаборатория) добавляется
исследование на p24 антиген.
При получении отрицательного результата во второй тест-системе
(антительной) сыворотка исследуется в тест-системе для определения
p24 антигена. При получении отрицательного результате делается
заключение об отсутствии антигена и антител к ВИЧ.
При получении положительного результата на p24 антиген
повторное обследование, на наличие антител, проводится через 2
недели после получения положительного результата и в дальнейшем
через каждые 2 недели до получения положительного результата в
подтверждающем тесте.
При отсутствии в лаборатории необходимых тест-систем повторное
обследование, на наличие антител (ИФА и ИБ), проводится через 2
недели после получения положительного результата в тест-системе
АГ/АТ и в дальнейшем согласно правилам обследования лиц с
неопределенным блотом.
ЧАСТЬ 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА CD4 Т-ЛИМФОЦИТОВ
НА ПРОТОЧНОМ ЦИТОМЕТРЕ У ПАЦИЕНТОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ
ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (ВИЧ)
Введение
Прогрессивное уменьшение количества CD4 Т-лимфоцитов является
одним из основных маркеров ВИЧ-инфекции и обуславливает развитие
вторичных заболеваний. Мониторинг количества CD4 Т-клеток
продолжает оставаться одним из главных критериев оценки
прогрессирования заболевания. Регуляpное исследование числа CD4 Т-
лимфоцитов необходимо для оценки эффективности высокоактивной
противоретровирусной терапии (ВААРТ).
Автоматизированные технологии для иммунофенотипирования впервые
появились в конце 70-х годов прошлого века. Первые проточные
цитометры имели один лазер и позволяли определять два
морфологических или собственных клеточных параметра - прямое (FSC)
и боковое (SSC) светорассеяние, соответствующие размеру и
гранулярности клетки, и одну флуоресценцию - внешний параметр.
В течение 20-ти лет определение положения клеточных популяций и
гейта (логического ограничения) осуществлялось на основе двух
морфологических параметров - гомогенный гейтинг (син. гейтирование
по светорассеянию). Для подсчета абсолютного количества CD4 клеток
использовалось общее количество лейкоцитов и процент лимфоцитов,
полученные на гематологическом анализаторе, и процент CD4,
полученный на проточном цитометре - двухплатформенный метод.
Данная методика позволяет исследовать только свежие образцы крови.
В начале 90-х годов появились первые публикации об
использовании специфичных лейкоцитарных (лимфоцитарных) маркеров в
комбинации с боковым светорассеянием для идентификации клеточных
популяций и определения положения гейта - гетерогенный гейтинг.
Результаты успешного использования маркеров CD3 и CD45 в
комбинации с боковым светорассеянием для определения положения
гейта были опубликованы в 1992 и 1994 г.г. соответственно. В
Европе и Северной Америке постепенно внедрялась методика с
использованием 3-х- и 4-х-цветной комбинации моноклональных
антител, включающей CD45, и одноплатформенный метод определения
абсолютного количества клеточных субпопуляций. При использовании
одноплатформенного метода подсчет абсолютных значений
осуществляется непосредственно на проточном цитометре -
волюметрическим методом или путем добавления к образцу частиц
известной концентрации. Данный подход устраняет необходимость
использования гематологического анализатора для подсчета
абсолютного количества клеток и позволяет увеличить сроки хранения
образцов до 72 часов, значительно уменьшает внутрилабораторную и
межлабораторную вариабельность абсолютных показателей CD3, CD4 и
CD8 Т-клеток. В настоящее время 4-х-цветный анализ с гейтированием
по CD45 и одноплатформенным методом является стандартной методикой
для определения CD4 Т-клеток у ВИЧ-инфицированных в Европе и
Северной Америке.
В начале нового столетия необходимость новой, более простой и
доступной технологии для подсчета CD4 Т-клеток стала очевидной. В
2002 г. Деборой Гленкросс была предложена методика PLG
(Panleukogating), в основе которой лежит использование общего
лейкоцитарного маркера CD45 в комбинации с боковым светорассеянием
для идентификации всей популяции лейкоцитов, и маркера CD4 в
комбинации с боковым светорассеянием для идентификации CD4
лимфоцитов. Первоначально этот метод был разработан, как
двухплатформенный: для подсчета абсолютного количества CD4 клеток
использовалось общее количество лейкоцитов, полученное на
гематологическом анализаторе. Преимущество данного подхода по
сравнению с традиционным двухплатформенным методом заключается в
том, что из подсчета абсолютного количества CD4 клеток исключается
наиболее уязвимое звено - определение процентного содержания
лимфоцитов на гематологическом анализаторе. Именно этот показатель
наиболее скомпрометирован у тяжелых пациентов с лимфопенией и
ранее всего страдает при старении образцов крови.
Позднее было предложено использовать методику PLG в качестве
одноплатформенного метода, с добавлением к образцу частиц для
абсолютного счета. В таком варианте методика позволяет
осуществлять подсчет общего количества лейкоцитов, процентное и
абсолютное содержание лимфоцитов, процентное и абсолютное
содержание CD4 клеток, исключая необходимость использования
гематологического анализатора.
В настоящее время PLG является стандартной методикой для
определения CD4 лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов в Южной
Африке из-за простоты и меньшей стоимости по сравнению с 4-х-
цветным анализом.
Выбор методики для подсчета CD4 должен осуществляться с учетом
особенностей и возможностей данной лаборатории. Рекомендуемыми
является 3-х- и 4-х-цветный анализ с гейтированием по CD45 или
методика PLG. Предпочтительным является одноплатформенный метод
подсчета абсолютных значений, однако при анализе свежих образцов
крови допускается использование двухплатформенного метода.
Безопасность работы в лаборатории
Вирус иммунодефицита человека относится ко II группе
патогенности, однако все манипуляции, связанные с
иммунологическими (серологическими) исследованиями, производятся
согласно Санитарным правилам "Безопасность работы с
микроорганизмами III и IV групп патогенности и гельминтами"
(Постановление Главного государственного санитарного врача
Российской Федерации от 3 февраля 1999 г. N 4).
Пользуйтесь правилами безопасности во время работы со всеми
образцами.
1. Надевайте лабораторную одежду и перчатки во время подготовки
образцов и работы на проточном цитометре.
2. Все манипуляции с образцами (открывание пробирок,
дозирование крови, реактивов, смешивание и т.д.) следует выполнять
в ламинарном шкафу, соответствующем III-IV биологической
безопасности (класс I-II по международной классификации).
3. Для дозирования крови и реагентов используйте безопасные
приспособления. Никогда не пипетируйте ртом.
4. После работы с образцами снимите перчатки и вымойте руки
водой с мылом.
5. Дезинфицируйте отходы проточного цитометра в соответствии с
рекомендациями производителя. Например, перед началом работы
налейте в пустой контейнер для отходов 5% гипохлорит натрия с
расчетом, чтобы конечная концентрация гипохлорита натрия в полном
контейнере составляла 0,5% (например, если объем контейнера 1
литр, необходимо добавить 100 мл 5% гипохлорита натрия).
6. Дезинфицируйте проточный цитометр в соответствии с
рекомендациями производителя. Один из возможных методов
дезинфекции путей потока жидкости цитометра заключается в
промывании в конце рабочего дня 0,5% раствором гипохлорита натрия
в течение 5-10 минут. После этого для удаления остатков
дезинфицирующего раствора следует промывать дистиллированной водой
или изотоническим раствором не менее 10 минут во избежание
повреждения путей потока жидкости.
7. Если образец был разлит, продезинфицируйте поверхность
раствором гипохлорита натрия или микобактерицидного
дезинфицирующего вещества. Гладкие и твердые поверхности
достаточно обрабатывать 0,05% раствором гипохлорита натрия, для
пористых поверхностей следует использовать 0,5% раствор
гипохлорита натрия.
8. После окрашивания и лизиса все образцы должны быть
зафиксированы.
Несмотря на то, что реагенты некоторых производителей уже
содержат фиксирующее вещество, которое уменьшает инфекционную
активность ВИЧ, ассоциированного с клеткой на 3-5 log,
эффективность этих веществ в отношении других инфекционных агентов
(например, вируса гепатита C) не была оценена. Для повышения
безопасности перед анализом на проточном цитометре в образцы можно
добавлять 500-1000 мкл 1% раствора параформальдегида (pH 7,0-7,4).
Преаналитический этап
Забор крови
Необходимо, чтобы образцы крови были правильно взяты и вовремя
доставлены в лабораторию. Нарушения, допущенные на
преаналитическом этапе, могут повлиять на результат исследования и
его дальнейшую интерпретацию.
Забор крови необходимо осуществлять утром натощак (с момента
последнего приема пищи должно пройти не менее 12 часов). В день
накануне взятия крови пациенту лучше воздержаться от употребления
алкоголя, большого количества пищи, в особенности жирной, а также
от чрезмерной физической нагрузки.
Забор крови необходимо осуществлять в положении пациента сидя
или лежа. Жгут следует снять сразу же после попадания иглы в вену.
Длительность наложения жгута не должна превышать 1 минуты. Взятие
крови должно осуществляться до проведения диагностических и
лечебных процедур. При проведении пациенту внутривенных вливаний,
пункцию вены для взятия крови необходимо осуществлять на другой
руке. При взятии пробы из артериальных или венозных катетеров,
канюлю следует промыть изотоническим солевым раствором
(физиологическим раствором), первые 5 мл крови следует выбросить,
а затем взять пробу.
Кровь собирается в вакуумную пробирку, содержащую
антикоагулянт. В качестве антикоагулянта лучше всего использовать
K3EDTA (1,5 +/- 0,15 мг на мл крови). Во избежание образования
сгустков необходимо хорошо перемешивать кровь с антикоагулянтом.
Перемешивание осуществляется путем переворачивания пробирки не
менее 8 раз. Применение миксеров и встряхивание пробирок
недопустимо, так как это приводит к гемолизу и получению неверных
результатов. Необходимо соблюдать правильное соотношение крови и
антикоагулянта. Недостаточное количество крови или переполнение
пробирки может привести к искажению результатов
иммунофенотипирования.
На пробирке с образцом должны быть указаны идентифицирующие
данные пациента и точное время забора крови. В сопроводительных
документах должны быть указаны фамилия, имя и отчество пациента,
возраст, пол, дата и время забора крови. В случае если в момент
обследования пациент принимает лекарственные препараты
(антибиотики, гормоны, цитостатики), в сопроводительной документах
должны быть сделаны соответствующие пометки.
Транспортировка образцов крови
Транспортировка образцов крови должна осуществляться при
комнатной температуре (18-25 град. C). Избегайте замораживания или
перегревания образцов, так как нарушение температурного режима
может повлиять на результаты иммунофенотипирования. После забора
крови образцы должны быть доставлены в лабораторию как можно
скорее. При транспортировке образцы должны находиться в
вертикальном положении.
При транспортировке образца внутри лечебно-диагностического
учреждения, пробирки с кровью должны находиться в контейнере,
который в случае повреждения пробирки будет предотвращать разлитие
крови. При транспортировке образцов за пределы лечебно-
диагностического учреждения, следуйте инструкциям, установленным в
данном регионе.
Пригодность образцов крови
Осмотрите пробирку с кровью сразу после того, как ее доставили
в лабораторию. Если пробирка холодная или горячая на ощупь, но
кровь в ней не заморожена и не имеет явных признаков гемолиза,
исследование образца допускается, однако в этом случае необходимо
сделать соответствующую отметку в регистрационном журнале и
отчетном документе. Не подвергайте образец быстрому охлаждению или
нагреванию, так как это может негативно повлиять на результаты
иммунофенотипирования.
Исследование образца не производится в следующих случаях:
1. Если кровь гемолизирована или заморожена.
2. Если кровь имеет видимые сгустки.
3. Если с момента забора крови прошло более 72 часов.
Во всех перечисленных случаях необходимо запросить новый
образец.
Подготовка образцов для анализа на проточном цитометре
1. Осуществляйте исследование в течение 48 часов
(предпочтительно), но не позднее 72 часов после забора крови.
2. Перед дозированием аккуратно перемешайте кровь для
равномерного распределения клеток.
3. При дозировании крови и частиц для абсолютного счета
необходимо строго соблюдать объемы, так как изменение объемов
могут повлиять на результаты иммунофенотипирования. Рекомендуется
использование методики обратного дозирования. Производители
предлагают частицы для абсолютного счета в виде суспензий или в
пробирках, содержащих необходимое количество частиц. При
использовании частиц в виде суспензии необходимо хорошо
встряхивать флакон с частицами перед дозированием. Частицы
добавляются в готовый образец непосредственно перед анализом на
проточном цитометре.
4. Хорошо перемешивайте кровь и реагенты на Вортексе на всех
этапах подготовки образцов (окрашивание, лизис, фиксации). Для
оптимального распределения клеток дополнительно встряхивайте
готовые образцы непосредственно перед исследованием на проточном
цитометре.
5. Во время окрашивания инкубируйте образцы в темноте.
6. Для одноплатформенной технологии подсчета абсолютного
количества CD4 Т-клеток необходимо использовать безотмывочный
метод.
7. После завершения подготовки образцов закройте пробирки с
готовыми образцами и поместите образцы в холодильник (t = 4-100
град. C) до анализа на проточном цитометре. Готовые образцы
следует хранить не более 24 часов.
Панели моноклональных антител
Для идентификации лейкоцитов и лимфоцитов используется CD45 в
сочетании с боковым светорассеянием (SS).
Для определения количества CD4 Т-клеток рекомендуемыми
комбинациями моноклональных антител являются:
CD45/CD3/CD4
CD45/CD3/CD4/CD8
CD45/CD4 (PLG)
В таблице 1 представлены панели моноклональных антител,
рекомендуемые Центром Контроля Заболеваемости (CDC.) Определение
количества CD19+ лимфоцитов может иметь значение при исследовании
иммунного статуса у детей.
Таблица 1
Панели моноклональных антител
-------------------------------T---------------------------------¬
¦3-цветная ¦4-цветная ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦CD45/CD3/CD4 ¦CD45/CD3/CD4/CD8 ¦
+------------------------------+ ¦
¦CD45/CD3/CD8 ¦ ¦
+------------------------------+---------------------------------+
¦CD45/CD3/CD19 <*> ¦CD45/CD3/CD19/CD16(56) <*> ¦
L------------------------------+----------------------------------
--------------------------------
<*> Дополнительная пробирка для определения количества CD19
используется в педиатрической практике.
Подготовка цитометра
Оптическая настройка
Большинство современных проточных цитометров имеют
фиксированную оптическую систему и не требуют ежедневной
настройки. Необходимо каждый день проверять правильность
настройки, используя специальные частицы - стандарты настройки
(см. раздел "Контроль качества").
Напряжение фотоэлектронных умножителей (ФЭУ, РМТ)
Для настройки напряжения ФЭУ можно использовать неокрашенную
лизированную кровь или специальные частицы, имеющие сходные с
клетками свойства. Настройка осуществляется вручную или в
автоматическом режиме (программное обеспечение современных
проточных цитометров позволяет осуществлять автоматическую
настройку напряжения ФЭУ). При использовании неокрашенной
лизированной крови напряжение следует настраивать таким образом,
чтобы популяция неокрашенных лимфоцитов (аутофлуоресценция) была
полностью видна и располагалась внутри нижнего левого квадранта на
двухпараметровых графиках (рис. 1 - не приводится). Ошибкой
является слишком высокое и слишком низкое напряжение (рис. 2 - не
приводится). Перед настройкой напряжения ФЭУ необходимо выключить
цветовую компенсацию (все показатели компенсации должны быть равны
нулю).
Рисунок 1. Настройка напряжения Фотоэлектронных
Умножителей по неокрашенной лизированной крови.
При правильно настроенном напряжении популяция
неокрашенных лимфоцитов (аутофлуоресценция)
полностью видна и располагается в первой декаде
логарифмической шкалы на гистограмме
и двухпараметровом графике
Рисунок не приводится.
Рисунок 2. Ошибки при настройке напряжения ФЭУ.
а) Слишком высокое напряжение.
б) Слишком низкое напряжение.
Рисунок не приводится.
Цветовая компенсация
Некоторые флуорохромы излучают свет, который проходит более чем
через один оптический фильтр прибора. Например, FITC излучает не
только зеленый, но и оранжевый свет, который проходит через
оранжевый оптический фильтр и генерирует сигнал в этом детекторе.
Чтобы устранить влияние других флуорохромов на флуоресценцию,
регистрируемую каждым конкретным детектором, необходимо
настраивать цветовую компенсацию. Под цветовой компенсацией
понимают электронную коррекцию флуоресценции, направленную на
устранение влияния других флуорохромов на интенсивность
флуоресценции, регистрируемой данным детектором. Для настройки
цветовой компенсации можно использовать автоматизированное
программное обеспечение, предлагаемое производителем проточного
цитометра, или осуществлять настройку вручную.
1. Выберите материал для настройки цветовой компенсации. Это
могут быть частицы или клетки, окрашенные соответствующим набором
флуорохромов и имеющие флуоресцентный сигнал, соответствующий
самому яркому сигналу клеток в исследуемых образцах. Наиболее
оптимальным является использование CD8. Если вы осуществляете
трехцветный анализ, вам необходимо иметь 4 популяции клеток или
частиц в разных пробирках: неокрашенную, окрашенную только FITC,
окрашенную только РЕ и окрашенную третьим флуорохромом. Для
четырехцветного анализа кроме четырех предыдущих вам потребуется
пятая популяция, окрашенная четвертым флуорохромом.
2. Анализируя неокрашенные клетки (частицы), настройте
напряжение ФЭУ, как описано в предыдущем разделе. Последовательно
анализируйте пробирки с клетками (частицами), окрашенными FITC,
РЕ, третьим и четвертым флуорохромом. Настраивайте цветовую
компенсацию таким образом, чтобы популяция, окрашенная FITC,
определялась только в канале FITC и не определялись в других
каналах, а среднее значение (mean) флуоресценции FITC в канале РЕ
и других каналах было равно среднему значению флуоресценции
негативной популяции. На двухпараметровых графиках клетки или
частицы, меченые FITC, должны располагаться в соответствующем
квадранте, не попадая внутрь двуположительного квадранта, а
воображаемая линия, соединяющая центры окрашенной и негативной
популяций должна быть параллельно соответствующей оси (рис. 3 - не
приводится). Избегайте чрезмерной компенсации.
Рисунок 3. Настройка цветовой компенсации
а) Правительная компенсация
б) Нет компенсации
в) Чрезмерная компенсация
Рисунок не приводится.
3. Если для настройки цветовой компенсации использовались
частицы, необходимо проверить правильность компенсации
исследованием окрашенных клеток.
4. Важно переустанавливать компенсацию после изменения
напряжения ФЭУ или замены оптических фильтров.
Исследование образца на проточном цитометре
Трехцветный (четырехцветный анализ)
График 1, CD45XSS.
Установите порог (ограничитель) на детекторе флуоресценции,
которым регистрируется CD45, как можно ближе к популяции
лейкоцитов. Настройте боковое светорассеяние таким образом, чтобы
все популяции лейкоцитов были видны на графике и хорошо отделялись
друг от друга. Нарисуйте гейт [R1; A] <*> вокруг лимфоцитов -
ярких СD45-положительных клеток со слабым боковым светорассеянием
(рисунки 4, 5 - не приводятся). Постарайтесь включить все
лимфоциты и избежать попадания в гейт моноцитов, имеющих более
слабое окрашивание по CD45 и более высокое боковое светорассеяние,
и базофилов, имеющих менее яркое свечение по CD45 и слабое боковое
светорассеяние.
Для получения точных абсолютных значений необходимо подсчитать
не менее 2500 лимфоцитов в каждом образце.
Чистота гейта и полнота включения лимфоцитов
При гейтировании по CD45 в сочетании с боковым светорассеянием
чистота гейта, как правило, оптимальна. При использовании
многоцветной панели моноклональных антител чистоту гейта и степень
контаминации моноцитами можно оценить по двухпараметровому графику
CD3/CD4. Моноциты являются СD4-положительными и CD3-негативными.
Контаминация моноцитами не должна превышать 3%.
Оценить полноту включения лимфоцитов можно только в том случае,
если исследуемая панель содержит маркеры T, B и NK клеток.
Графики 2 и 3; гейт [R1; A]
Установите визир таким образом, чтобы негативная и окрашенная
популяции были отделены друг от друга. Исследуемые популяции
клеток CD3+CD4+ и CD3+CD8+ будут отображены в квадранте [UR; B2,
C2] на графиках 2 и 3, соответственно. Процентное содержание
исследуемой популяции клеток и соответствующее ей количество
событий будет отображено в таблице статистики для данного графика
по окончанию сбора данных.
График 4 или гистограмма 5
Определите количество частиц, используя негейтированный график
или гистограмму. Частицы разных производителей имеют разную
интенсивность флуоресценции. Выберите детектор флуоресценции,
который дает наилучшее разрешение между клетками и частицами.
Нарисуйте гейт [R2; D] <*> для частиц. Количество частиц в гейте
по окончанию сбора данных будет отображено в таблице статистики
для данного графика (гистограммы).
--------------------------------
<*> В квадратных скобках (здесь и далее по тексту) указаны
обозначения, используемые Becton Dickinson и Beckman Coulter,
соответственно.
Подсчет абсолютного количества CD4 Т-клеток
Абсолютное число CD4 Т-клеток в 1 мкл крови =
количество событий общее количество
в квадранте [UR; С2] добавленных частиц <*>
-------------------- x ----------------------
количество частиц объем крови
в гейте [R2; D]
Подсчет абсолютного количества CD4 клеток (примеры)
FACSCalibur, частицы TruCount, общее количество частиц 49930
543 49930
---- x ----- = 474 CD4 кл/мкл
1144 50
Epics XL, частицы FlowCount, количество частиц: 1058 в 1 мкл
суспензии (рисунок 2)
859 1058 x 100
---- x ---------- = 821 CD4 кл/мкл
1107 100
Производители проточных цитометров предлагают программное
обеспечение, облегчающее подсчет абсолютного количества клеток.
Рисунок 4. Четырехцветный анализ
Рисунок не приводится.
Рисунок 5. Четырехцветный анализ
Рисунок не приводится.
5.2. Методика PLG (рисунок 6 - не приводится)
График 1, CD45XSS
Установите порог (ограничитель) на детекторе флуоресценции CD45
или детекторе FSC. Настройте SS таким образом, чтобы все популяции
лейкоцитов были хорошо видны. Боковое светорассеяние может быть
настроено как по линейной, так и по логарифмической шкале.
Нарисуйте гейт А, включив все СD45-положительные клетки
(лейкоциты). Необходимо собрать не менее 20000 клеток.
Нарисуйте гейт В вокруг ярких СD45-положительных клеток с
низким боковым светорассеянием (лимфоциты).
График 2, CD4XSS; гейт А
Нарисуйте гейт С вокруг СD4-положительных клеток с низким
боковым светорассеянием. Избегайте контаминации моноцитами.
График 3, CD4XSS; гейт АВ
Нарисуйте гейт D вокруг СD4-положительных клеток. График
предназначен для определения процентного содержания CD4 клеток.
График 4 или Гистограмма 4 (для одноплатформенной технологии)
Определите количество частиц, используя негейтированный график
или гистограмму. Частицы разных производителей имеют разную
интенсивность флуоресценции. Выберите детектор флуоресценции,
который дает наилучшее разрешение между клетками и частицами.
Нарисуйте гейт Е для частиц.
Рисунок 6. Методика PLG
Рисунок не приводится.
Подсчет абсолютного количества CD4 клеток осуществляется по
формуле:
Абсолютное число CD4 Т-клеток в 1 мкл крови =
количество событий общее количество
в гейте С добавленных частиц <*>
------------------ x ----------------------
количество частиц объем крови
в гейте Е
Подсчет абсолютного количества CD4 Т-клеток (для
двухплатформенной технологии)
Абсолютное число CD4 Т-клеток =
количество событий в гейте С х WBC
---------------------------------- ,
количество событий в гейте А
где: WBC-общее количество лейкоцитов, полученное на
гематологическом анализаторе.
Контроль качества иммунофенотипирования
Внутрилабораторный (внутренний) контроль качества
Под контролем качества понимают систематическую процедуру,
выполняемую в лаборатории с целью оценки точности и правильности
исследования и предупреждения ошибок на всех этапах подготовки и
анализа образца. Всесторонний контроль качества включает контроль
состояния проточного цитометра, процесса подготовки и исследования
образца.
Таблица 2
-----------------------------------------------------------------¬
¦ Всесторонний контроль качества ¦
¦ / \ ¦
¦ / \ ¦
¦ \/ \/ ¦
¦Проточный цитометр Подготовка образца¦
+-----------------------------T----------------------------------+
¦Параметры состояния ¦ ¦
¦системы: ¦- Лизис ¦
¦- Чувствительность ¦- Фиксация ¦
¦- Линейность ¦- Стабильность моноклональных ¦
¦- Динамический диапазон ¦антител ¦
¦ ¦- Точность и аккуратность ¦
¦ ¦подготовки пробы ¦
¦- Настройка инструмента: ¦ ¦
¦- Оптическая настройка ¦ ¦
¦- Окно анализа ¦ ¦
¦- Цветовая компенсация ¦ ¦
+-----------------------------+----------------------------------+
¦ Аналитический контроль ¦
¦- Сумма CD4 + CD8 = CD3 ¦
¦- Сумма CD3 + CD19 + CD 16/56 = 100% ¦
¦- Репликаты Т-клеток ¦
L-----------------------------------------------------------------
Большинство современных проточных цитометров имеют
фиксированную оптическую систему, и не требуют настройки. Однако
пользователю проточного цитометра настоятельно рекомендуется
ежедневно использовать стандарты настройки, для того чтобы
убедиться в правильности оптической настройки и системы потока
жидкости прибора.
При исследовании стандартов настройки пики на графике,
соответствующем каждому детектору, должны быть максимально яркие,
узкие и гомогенные, CV<2%. Положение пика на графиках должно
соответствовать ранее установленным целевым значениям. Смещение
пика может свидетельствовать о загрязнении или попадании пузырей
воздуха в систему потока жидкости, а также о неисправности
прибора. Увеличение ширины пика свидетельствует об ухудшении
разрешения популяций.
Параметры состояния прибора
Параметры состояния, такие как линейность, чувствительность и
динамический диапазон прибора, можно определить по калибровочному
графику и использовать для контроля состояния прибора. Для этого
используются стандарты калибровки. Некоторые производители
предлагают программное обеспечение для обработки данных калибровки
и построения калибровочных графиков.
Настройка цитометра
Удобным и продуктивным методом стандартизации настроек прибора
является использование целевых каналов. Для этого применяют
референсные стандарты.
Настройте напряжение ФЭУ и цветовую компенсацию как описано в
предыдущих разделах. Используя полученные настройки, исследуйте
референсные стандарты. Положение пика на графиках (MdX) является
вашим целевым каналом. Запишите значение целевого канала для
каждого детектора и соответствующие им значения напряжения ФЭУ.
Эти настройки определяют положение окна анализа для данного
исследования. Регулярно анализируйте референсные стандарты и
контролируйте положение пика на графиках. Значение MdX для каждого
детектора должно быть сходным изо дня в день. Регулируйте
напряжение ФЭУ таким образом, чтобы референсные стандарты попадали
в целевой канал. Значительное смещение пика на графике может
свидетельствовать об изменениях в системе потока жидкости (грязь,
пузыри воздуха) или о неисправности фотоэлектронных умножителей.
Подготовка образца
Дозирование
При использовании одноплатформенной технологии подсчета
абсолютного количества CD4 Т-лимфоцитов точность дозирования крови
и частиц для абсолютного счета является необходимым условием для
получения правильных абсолютных значений. Для того, чтобы быть
уверенным в точности дозирования, необходимо осуществлять контроль
процедуры дозирования и состояния пипетки.
Точность дозирования можно оценить следующим образом. Дозируйте
100 мкл дистиллированной воды, используя методику обратного
дозирования, взвесьте и запишите вес. Повторите процедуру десять
раз, подсчитайте среднее значение и коэффициент вариации (CV). При
комнатной температуре вес 100 мкл воды составляет 0,1000 г,
среднее же значение должно быть между 0,0980 и 0,1020 г, a CV<2%.
Важную роль играет выбор наконечников для пипетки, температура
дозируемых веществ и помещения.
Стабильность моноклональных антител
Необходимо оценивать стабильность моноклональных антител, если
вы титруете их или используете долее срока, рекомендуемого
производителем. Для этого свежую цельную кровь окрашивают
моноклональными антителами и осуществляют мониторинг средней
интенсивности флуоресценции в каждом последующем разведении или
после истечения срока использования, рекомендуемого
производителем.
Лизис и фиксация образцов
Использование гейтирования по CD45 в комбинации с боковым
светорассеянием позволяет осуществлять анализ даже в случае
неполного лизиса эритроцитов в образце, так как CD45 позволяет
эффективно отделить лейкоциты от эритроцитов, тромбоцитов и
дебриса. Завершенность лизиса может быть оценена по графику с
использованием гейта по светорассеянию (FSXSS).
Свежий раствор формальдегида готовится раз в неделю,
фильтруется, определяется pH. На емкости указывается дата
приготовления раствора и срок годности.
Стабилизированные контрольные материалы
Для контроля правильности исследований можно использовать
контрольные материалы - стабилизированную кровь с известным
содержанием клеточных популяций. Разные производители предлагают
готовую стабилизированную кровь или стабилизатор для приготовления
контрольного материала.
Подготовьте образец, пользуясь вашими обычными методиками, и
исследуйте его на проточном цитометре. Полученные значения
сравните с предлагаемыми производителем. Рекомендуется регулярно
исследовать контрольный материал и подсчитывать коэффициент
вариации.
Скорость потока частиц
При использовании одноплатформенной технологии существует
дополнительный способ оценки правильности дозирования. Поскольку
теоретически все образцы содержат одинаковое количество частиц,
скорость потока частиц является относительно постоянной.
Подсчитать скорость потока частиц (количество частиц в секунду)
можно разделив количество частиц, собранных во время исследования
образца, на время анализа. Коэффициент вариации скорости потока
частиц от образца к образцу должен составлять около 5%. Если CV
значительно превышает 5%, точность дозирования не является
оптимальной. Если в отдельном образце скорость потока частиц
значительно больше или меньше средней скорости, абсолютные
показатели могут быть значительно скомпрометированы. В этом случае
необходимо повторить подготовку и исследование образца.
Аналитический контроль
Сумма Т-клеток
В случае если исследуемая панель кроме CD4 включает CD8 и CD3,
сумма процентного содержания CD4+CD3+ и CD8+CD3+ клеток должна
быть равна процентному содержанию CD3+ клеток +/- 5%. Сумма может
быть меньше при высоком содержании в образце гамма дельта Т-
клеток.
Репликаты Т-клеток
Если исследуемая панель включает более одной пробирки,
содержащей одинаковый маркер (например, CD3), можно сравнить его
содержание в разных пробирках. Разница не должна превышать 2%.
Сумма лимфоцитов
Если исследуемая панель включает T, B и NK клетки, сумма всех
популяций может служить дополнительным контролем правильности
измерений и должна составлять 100 +/- 10%.
ЧАСТЬ 3. ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ
НА ВИРУСНУЮ НАГРУЗКУ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
Введение
Внедрение антиретровирусных (АРВ) препаратов в практику терапии
ВИЧ-инфицированных пациентов позволило значительно увеличить
продолжительность и улучшить качество жизни таких пациентов. Под
действием лекарственных препаратов удается подавить вирусную
репликацию до минимального уровня. Слежение за изменением
концентрации ВИЧ в процессе противовирусной терапии позволяет во
время оценить ее эффективность и в случае неудачи подобрать новую
комбинацию препаратов. В настоящее время концентрация PHК ВИЧ в
плазме крови (или вирусная нагрузка) является одним из важнейших
показателей как на этапе назначения терапии, так и в процессе
терапии. Изучая изменение концентрации PHК ВИЧ в процессе лечения,
можно судить об эффективности терапии уже через 2-4 недели от ее
начала.
Существует несколько подходов для количественного определения
PHК ВИЧ: полимеразная цепная реакция (ПНР) с детекцией продуктов
амплификации с помощью гибридизационно-ферментного анализа (ГИФА)
или в режиме реального времени (Real-time), изотермальная
амплификация (NASBA) и разветвленная ДНК-гибридизация (bDNA). В
России наибольшее распространение получили тест-системы, в основе
которых лежит ПЦР с детекцией продуктов амплификации в ГИФА
формате.
Разработанный недавно метод ПЦР с детекцией продуктов
амплификации в режиме реального времени (Real-Time ПЦР) позволил
значительно расширить возможности молекулярной диагностики. Суть
метода заключается в том, что в процессе накопления продуктов
амплификации происходит увеличение флюоресцентного сигнала,
который регистрируется с помощью специального прибора,
позволяющего осуществлять детекцию продуктов ПЦР в режиме
реального времени. Так как кинетика накопления продуктов
амплификации зависит от исходного количества матрицы, то возможно
оценить количество исходного продукта. Отсутствие отдельной стадии
детекции позволяет уменьшить риск контаминации продуктами ПЦР и,
таким образом, упростить требования, предъявляемые к организации
ПЦР-лаборатории. Поскольку регистрация результатов проводится
непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в
одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном
помещении для детекции продуктов амплификации.
Показания к проведению теста на вирусную нагрузку
Показания и назначения теста на вирусную нагрузку:
1. До начала АРВ терапии каждые 3 месяца в зависимости от
стадии заболевания и количества CD4+ клеток до момента принятия
решения о начале лечения. Концентрация PHК ВИЧ выше 100000
копий/мл считается показателем неблагоприятного прогноза течения
заболевания.
2. После принятия решения о начале АРВ терапии вирусную
нагрузку необходимо определять перед началом лечения, через 1, 3
месяца после начала лечения и затем каждые 3 месяца для принятия
решения о продолжении или смене терапии на основании критериев
неэффективности терапии.
3. У беременных ВИЧ-инфицированных женщин за 4 недели до
предполагаемых родов для принятия решения о проведении кесарева
сечения.
Вирусологические критерии неэффективности терапии:
1. Отсутствует снижение концентрации PHК ВИЧ через 1 месяц
лечения больше чем на 0,5 lg (приблизительно в 3 раза) для
взрослых и детей старше 2 лет и больше чем на 0,7 lg
(приблизительно в 5 раз) для детей младше 2 лет.
2. Отсутствует снижение концентрации PHК ВИЧ до
недетектируемого уровня через 6 месяцев лечения.
3. Выявление PHК ВИЧ (в двух определениях с интервалом 1 месяц)
после исходной супрессии до недетектируемого уровня.
НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ВИРУСНУЮ НАГРУЗКУ в
течение 4-х недель после перенесенного острого инфекционного
заболевания, не относящегося к вторичным заболеваниям ВИЧ-инфекции
или после проведения вакцинации.
Принципы организации лаборатории для проведения
исследования крови на вирусную нагрузку
Лабораторию для проведения исследования крови на вирусную
нагрузку размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части
здании) с соблюдением требованием СП 1.2.731-99 - М., 1999
"Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
и гельминтами" и учетом особенностей устройства ПЦР-лаборатории,
изложенных в методических указаниях "Организация работы при
исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного
микроорганизмами I-II групп патогенности" МУ 1.3.1794-03 - М.,
2003.
Рабочая зона лаборатории для проведения исследования на
вирусную нагрузку в соответствии с этапами анализа должна включать
определенный набор последовательно расположенных самостоятельных
помещений:
- Для подготовки проб, выделения PHК - зона 1.
- Для приготовления реакционных смесей, проведения обратной
транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) или
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР
Realtime) - зона 2.
- Для проведения гибридизационно-ферментной детекции продуктов
ПЦР (ГИФА) - зона 3.
Материально-техническое обеспечение исследования
на вирусную нагрузку
Реактивы
Сертифицированные тест-системы для определения вирусной
нагрузки ВИЧ.
Оборудование и материалы
ЗОНА 1
Для этапа выделения PHК из клинического материала требуются:
1. Настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный
ламинарный шкаф.
2. Термостат для пробирок типа "Эппендорф" на 25-100 град. C.
3. Микроцентрифуга для пробирок типа "Эппендорф" до 16 тыс.
об./мин.
4. Центрифуга с охлаждением (21-25 тыс. g).
5. Вортекс.
6. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для
удаления надосадочной жидкости.
7. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
8. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.
9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно
закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл.
10. Штативы для микропробирок на 1,5 мл и наконечников.
11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до
200 и 1000 мкл.
12. Холодильник от 2 до 8 град. C и на минус 18 +/- 2 град. C.
11. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим
раствором.
ЗОНА 2
Для проведения реакции обратной транкрипции и этапа
амплификации требуются:
1. Амплификатор.
2. Амплификатор для проведения ПЦР в режиме "реального
времени".
3. Настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный
ламинарный шкаф.
4. Вортекс.
5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема.
6. Штативы для микропробирок на 0,5 (0,2) мл и наконечников.
7. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5
(0,2) мл.
8. Одноразовые наконечники для микропипеток с аэрозольным
барьером до 200 мкл.
9. Холодильник от 2 до 8 град. C и на минус 18 +/- 2 град. C.
10. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
11. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим
раствором.
ЗОНА 3
Для гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР
требуются:
1. Холодильник от 2 до 8 град. C.
2. Плашечный термостат (температурный режим 37 град. C).
3. Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.
4. Мерный цилиндр.
5. Отдельный набор одноканальных автоматических пипеток
переменного объема.
6. Отдельная 8-канальная автоматическая пипетка переменного
объема.
7. Плашечный спектрофотометр.
8. Вошер (по потребности).
9. Одноразовые наконечники для микропипеток до 200 мкл.
10. Емкость для сброса наконечников с дезинфицирующим
раствором.
Сбор, хранение и транспортировка образцов для
проведения исследования крови на вирусную нагрузку
Способы сбора, условия хранения и транспортирования материала
для определения вирусной нагрузки ВИЧ должны соответствовать
требованиям СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности".
Для проведения исследования по определению вирусной нагрузки
ВИЧ может быть использована только плазма крови. Цельная кровь в
количестве не менее 5 мл должна собираться в одноразовую пробирку
с 3% ЭДТА в соотношении 1:20. После забора пробирка с кровью
закрывается крышкой, перемешивается переворачиванием 3-4 раза и
хранится при температуре +2-8 град. C не более 6 часов. Плазма
крови должна быть отобрана не позднее 6 часов после забора крови.
Для этого пробирку с цельной кровью необходимо центрифугировать
при 800-1600 g в течение 20 минут. Хранить плазму можно длительно
при температуре -70 град. C. Если планируется повторное
исследование плазмы на вирусную нагрузку, рекомендуется сделать
аликвоты исходного образца плазмы объемом, необходимым для
проведения исследования и хранить при температуре -70 град. C. Не
рекомендуется замораживать/оттаивать плазму более 2-х раз.
Пробоподготовка (выделение PHК ВИЧ-1)
Для повышения чувствительности тест-систем рекомендуется
использовать методику предварительного ультрацентрифугирования
плазмы крови. Для этого 1 мл плазмы крови пациента центрифугируют
в течение 1 часа при температуре +2-8 градусов при 24000 g в
ультрацентрифуге, супернатант удаляют, а полученный осадок
вирусных частиц выделяют по описанной в тест-системе методике.
Выделения PHК ВИЧ-1 проводится с помощью методики, основанной
на специфической обратимой сорбции PHК в присутствии хаотропных
солей (гуанидинтиоцианат) на частицах силикагеля и последующей
отмывке сорбента с PHК от белков, солей и других ингибиторов ПНР.
В основе количественных тестов лежит принцип одновременного
тестирования образца плазмы крови с внутренним контрольным
образцом. Внутренний контрольный образец (ВКО) с известной
концентрацией PHК добавляется в каждую пробу на этапе выделения
PHК и в результате проходит через все этапы анализа одновременно с
изучаемым образцом крови. Концентрация PHК ВКО подобрана таким
образом, чтобы конкуренция на этапе ПНР между анализируемой
матрицей и ВКО была минимальна в заданном диапазоне измерения.
При тестировании любого количества образцов крови необходимо
параллельно тестировать 2 положительных контрольных образца с
высокой и низкой концентрацией PHК ВИЧ и отрицательного
контрольного образца.
Выделенную из плазмы крови PHК хранить не рекомендуется из-за
ее крайней нестабильности.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
с детекцией продуктов в режиме реального времени
(Real-Time ПЦР)
Для проведения реакции обратной транскрипции выделенная PHК
инкубируется в реакционном буфере с MuLV-ревертазой при
температуре 40 град. C, а затем полученная комплиментарная ДНК
(кДНК) поступает в ПЦР или хранится в холодильнике при температуре
от -15 град. C до -25 град. C до проведения ПЦР не более двух
недель или при -70 град. C длительно.
Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени
используется TaqMan-подход, основанный на использовании 5'-
экзонуклеазной активности полимеразы и гибридизационно-
флюоресцентного зонда.
Интерпретация результатов
Результаты интерпретируются на основании наличия (или
отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на
соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию
(или отсутствию) значения порогового цикла "Ct" в соответствующей
графе в таблице результатов.
В процессе Real-Time ПЦР необходима постановка ДНК-калибраторов
ВИЧ и ВКО для построения калибровочной кривой, с помощью которой
осуществляется расчет концентрации кДНК ВИЧ и ВКО в исследуемых
образцах. Построение калибровочной кривой и расчеты концентрации
кДНК осуществляются с использованием программного обеспечения
используемого прибора.
Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция
с детекцией продуктов в формате ГИФА
Для проведения ПЦР с детекцией результатов в ГИФА формате
используется совмещенный вариант обратной транскрипции и ПЦР. При
этом выделенная PHК добавляется в реакционный буфер, содержащий
фермент AMV-ревертазу (обратную транскриптазу) нуклеотиды, ДНК
полимеразу, прямой и обратный праймеры, меченые биотином. Т.о., в
процессе ПЦР нарабатывается продукт, меченый биотином, который
затем используется в гибридизационно-ферментном анализе.
В случае проведения ГИФА детекции продуктов ПЦР полученный
ампликон поступает в 3 зону. При работе в помещении для проведения
ГИФА необходимо строго соблюдать следующие требования:
- работать только в одноразовых перчатках и вести журнал уборки
помещений;
- проводить обработку рабочей поверхности стола, пипеток,
штативов для пипеток, штативов для ПЦР-пробирок, плашечного
термостата 70% спиртом до начала работы и по окончании каждой
постановки ГИФА;
- проводить обработку рабочей поверхности стола, пипеток,
штативов для пипеток, штативов для ПЦР-пробирок, плашечного
термостата 1% свежеприготовленным хлорамином, затем, выдержав 20
минут, промыть водой и обработать 70% спиртом в конце работы;
- каждый месяц проводить мытье сборника для дистиллированной
воды: обработка хромпиком всей внутренней поверхности, затем
тщательная отмывка водой - не менее 20 раз;
- каждые 4 месяца необходимо менять шланги для дистиллятора и
проводить генеральную уборку помещения;
- автоклавировать цилиндр, наконечники, банки для воды и
отмывки, ванночки, дистиллированную воду (режим автоклавирования:
20 минут при температуре 132 град. C и давлении 2,2 атм.)
Проведение ГИФА и интерпретация результатов
Микропланшет для проведения гибридизационно-ферментного анализа
устроен следующим образом: планшет состоит из 12 стрипов, каждый
из них используется для анализа одного образца; верхние 6 лунок
стрипа покрыты зондом, комплементарным ВИЧ-ампликону, нижние 2
лунки покрыты зондом, комплементарным ампликону внутреннего
контрольного образца. В лунках стрипа осуществляется 5-кратная
титровка ампликона.
Гибридизационно-ферментный анализ состоит из 5 этапов:
1. Реакция гибридизация ампликона с ДНК-зондом с последующей
отмывкой от не связавшихся продуктов.
2. Реакция взаимодействия гибрида, меченого биотином, с
конъюгатом стрептавидин-пероксидазы с последующей отмывкой от не
связавшихся продуктов.
3. Окисление тетраметилбензидина (ТМБ) пероксидазой с
образованием голубого окрашивания.
4. Остановка реакции раствором серной кислоты с образованием
желтого окрашивания.
5. Детекция полученных результатов с помощью спектрофотометра.
После получения результатов оптической плотности в стрипе
выбирают наименьший оптический сигнал, попадающий в диапазон
измерения спектрофотометра, указанный в инструкции, и умножают его
на соответствующее разведение ампликона. Таким образом, получают
общую оптическую плотность. Концентрация PHК вычисляется по
следующей формуле: общая оптическая плотность для образца делится
на общую оптическую плотность для ВКО и умножается на показатель,
отражающий концентрацию внутреннего контрольного образца,
добавленного в исследуемый образец (см. пункт 6).
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ
Собственные параметры клетки: морфологические параметры (размер
и гранулярность), определяемые характеристиками светорассеяния
(прямого и бокового).
Внешние параметры клетки: параметры поверхностного
флуоресцентного окрашивания.
Гомогенный гейтинг: основан на определении двух собственных
клеточных параметров или двух внешних параметров.
Гетерогенный гейтинг: основан на сочетании собственного
клеточного и внешнего параметров (морфологической характеристики и
флуоресцентного окрашивания).
Двухплатформенная технология: в подсчете абсолютного количества
клеток задействованы 2 прибора: проточный цитометр и
гематологический анализатор.
Одноплатформенная технология: подсчет абсолютного количества
клеток осуществляется на проточном цитометре.
Методика обратного дозирования: рекомендуется для более точного
соблюдения объемов. Электронные пипетки, как правило, имеют
автоматический режим обратного дозирования Pr. В данном случае
следуйте инструкции производителя. Методика обратного дозирования
может быть выполнена с использованием обычной пипетки. Нажмите на
контрольную кнопку глубже (шаг 2), опустите наконечник в емкость с
дозируемой жидкостью, затем медленно отпустите кнопку. Таким
образом, в наконечнике окажется дополнительный объем дозируемой
жидкости. Выпустите жидкость, нажимая контрольную кнопку, как
обычно (шаг 1). Таким образом, в наконечнике останется небольшой
объем жидкости. Не отпуская кнопки, снова опустите наконечник в
емкость с дозируемой жидкостью и наберите новый объем. Дозируйте
его, как и в первый раз. В наконечнике должен постоянно оставаться
небольшой объем жидкости.
Стандарты настройки (выравнивания): частицы с высокой
однородностью и высокой интенсивностью флуоресценции, используемые
для верификации оптической настройки и оптимизации системы потока
жидкости.
Разрешение: способность прибора различать сигналы разной
интенсивности и, таким образом, обеспечивать хорошее разделение
популяций клеток в исследуемых образцах. Разрешение зависит от
правильности оптической настройки.
Стандарты калибровки: содержат популяции частиц с разной
интенсивностью флуоресценции, окрашенные разными флуорохромами.
Используются для оценки параметров состояния системы: линейности,
чувствительности и динамического диапазона.
Линейность: способность прибора давать результат прямо
пропорциональный количеству исследуемого параметра в образце.
Чувствительность: минимальная флуоресценция, которую способен
определять прибор.
Динамический диапазон: спектр интенсивности флуоресценции,
который может быть измерен прибором.
Референсные стандарты: частицы, окрашенные флуорохромами, с
интенсивностью флуоресценции близкой к интенсивности флуоресценции
клеток в исследуемых образцах, которые используются для установки
окна анализа.
Окно анализа: спектр интенсивности флуоресценции, измеряемой
прибором при определенных настройках.
Целевой канал: положение пика (MdX) внутри окна анализа при
исследовании референсных стандартов. Используется для
стандартизации настроек прибора.
Коэффициент вариации (CV): отражает вариабельность значения
показателя при определении его одним и тем же методом несколько
раз. Определяется по формуле: CV = SD/Mean x 100%, где SD -
стандартное отклонение, Mean - среднее значение.
|
